A disztrofin fehérjecsalád: lokalizáció és fiziológiás szerep

Abstract

A Duchenne-féle izomdisztrófia (DMD) az izomrendszer sorvadásával járó, X-kromoszómához kötött örökletes betegség. A DMD ma még gyógyíthatatlan betegség, melynek kialakulásáért a disztrofin génben bekövetkező mutáció és közvetve, a mutáció miatt a disztrofin fehérje termelődésének zavara a felelős. A disztrofin fehérje a harántcsíkolt izomrostot határoló membránban található fehérje komplex, a disztrofin-asszociált fehérje komplex (Dystrophin-Associated Protein Complex, rövidítve: DAPC) fontos tagja. A DAPC feladata, hogy összeköttetést biztosít az extracelluláris mátrix komponensei és az aktin alapú sejtváz között és ezáltal stabilizálja az izomrostot az izomösszehúzódások során. Ezen kívül a komplex számos jelátviteli fehérjét, receptorfehérjét, ioncsatornát képes a membránhoz kihorgonyozni, így jelátviteli utakat befolyásolni. A DMD betegek egy részében az izomsorvadás mellett enyhe, szelektív kognitív károsodások is megjelennek. A verbális IQ, az olvasási képesség, a szövegértés és a tanulási képesség érintett, emellett memóriazavarok is előfordulhatnak. Ezek a tünetek arra utalnak, hogy a DAPC az idegi működésben is fontos szerepű. Számos kutatás bizonyítja, hogy a központi idegrendszer ideg- és gliasejtjeiben a disztrofin mellett egyéb DAPC fehérjék is jelen vannak, melyek kölcsönhatásba lépnek egymással, kialakítva ezzel a különböző disztrofin-asszociált fehérje komplexeket. Az agyban leggyakrabban előforduló disztrofin fehérje a Dp71. Az utrofin fehérje a disztrofin fehérje autoszomális homológja, szerkezetük nagyon hasonló és részben helyettesíthetik is egymást a DAPC-ben. A disztrofin-rokon és disztrofin-kötő disztrobrevinek (DB-ek) fontos tagjai a DAPC-nek, mert a jelátviteli utakban részt vevő adapter molekulákat, a szintrofinokat képesek a komplexhez hozzákapcsolni. A disztrobrevinek csak a disztrofinon, vagy az utrofinon keresztül tudnak a DAPC-hez kötődni. A komplexet alkotó fehérjék lokalizációjáról és kolokalizációjáról, azaz az agyban előforduló DAPC-k fehérje összetételéről és a komplex szerepéről még hiányosak az ismereteink. Érdekes kérdés ugyanezen DAPC-fehérjék előfordulásának vizsgálata a disztrofin fehérjét nem termelő mutáns egerekben. Mivel az agyon belül a vér-agy gát kialakításában szerepet játszó kapillárisok körül is számos DAPC fehérjét kimutattak, felmerül, hogy az egyéb szöveti gátakat létrehozó szervekben (mint a herében, tüdőben) vajon előfordulnak -e DAPC fehérjék. PhD munkám során a DAPC egyes tagjainak lokalizációját és karakterizációját végeztük el vad típusú egér és patkány illetve az egyik disztrofin formát sem termelő mdxβgeo egerek agyában, valamint vad típusú egerek heréjében és tüdejében. Morfológiai bizonyítékot szolgáltattunk a Dp71f disztrofin izoforma ultrastrukturális lokalizációjára a patkány hippocampus CA3 régiójának stratum lucidum rétegében. A Dp71f fehérjét axo-dendritikus és tüskeszinapszisok posztszinaptikus denzitásában mutattuk ki. A jelölt és az ezektől morfológiailag megkülönböztethetetlen immunnegatív szinapszisok heterogén eloszlást mutattak. A moharostok terminálisai által adott szinapszisokban a Dp71f nem fordult elő. A szinaptikus helyeződésen kívül a Dp71f egyes mielinhüvely nélküli és mielinhüvelyes axonokban is megtaláltuk. A kötegeket képző mielinhüvely nélküli moharostokban az immunreakció az axonális membránt jelölte körbe, a mielinhüvelyes axonokban a jelölés az axoplazmában, a sejtváz elemeihez kapcsolódott. Más, szerkezetileg hasonló mielinhüvelyes axonokban jelölés nem volt. További kísérleteinkben néhány DAPC fehérje lokalizációját és kolokalizációját vizsgáltuk az agyi erekben vad típusú és mdxβgeo egerekben. Az α-DB fehérje az agyi erek falában az asztrocita végtalpakban 2 van jelen, ezért feltételezhető, hogy szerepet játszik az itt kialakuló vér-agy gát működésében. Az α-DB és az utrofin fehérjék, illetve az α-DB és β-DB fehérjék vad típusú egérben minden vizsgált agyterületen a kapillárisok falában kolokalizálódtak. A disztrofin fehérjét nem termelő mdxβgeo állatok és a vad típusú egerek összehasonlítása alapján az összes vizsgált agyterületre vonatkozóan a mutáns állatokban sokkal kevesebb ér volt immunpozitív. Ultrastrukturális vizsgálatokból derült ki, hogy az immunjelölés a perikapilláris asztrocita végtalpakban jól észrevehetően lecsökkent. Az α-DB fehérjét az agyi ereken kívül idegsejtekben is kimutattuk (Bregma -1,22 mm és -1,94 mm közötti területen) vad típusú és mdxβgeo egerekben. Az immunpozitív idegsejtek túlnyomó részt a laterális hypothalamus területén szétszóródva, illetve egy kisebb csoport a hypothalamus dorso-mediális régiójában lokalizálódtak. A fehérje az idegsejtek sejttestében, nyúlványaiban és szinapszisaiban található meg. Az elektronmikroszkópos kísérleteinkben tisztáztuk, hogy az α-DB az erősen kitágult endoplazmatikus retikulum ciszternáinak membránjához kötődik. A jelölt sejttestek közelében immunpozitív és immunnegatív nyúlványokat és posztszinaptikus denzitásokat is találtunk. Valószínűsíthető, hogy az α-DB tartalmú nyúlványok és posztszinaptikus denzitások az immunpozitív sejttestekhez tartoznak. Bebizonyítottuk, hogy az általunk vizsgált α-DB izoformák közül csak az α- DB2 és/vagy az α-DB4 expresszálódik az immunpozitív idegsejtekben. Az α-DB2/α-DB4 a neuronok citoplazmájában a β-DB-vel kolokalizálódott a laterális hypothalamus területén, egy körülhatárolható neuron csoportban. A β-DB a citoplazmán kívül a neuronok sejtmagjában is megjelent. A β-DB olyan neuronokban is kimutatható volt, amelyek α-DB2/α-DB4-et nem tartalmaztak. Az α-DB2/α-DB4 az utrofinnal, az nNOS-sal, NPY-al és a galaninnal nem kolokalizálódott, de bebizonyítottuk, hogy az α-DB2/α-DB4 pozitív idegsejtek MCH neuropeptidet is expresszálnak vad típusú és mdxβgeo egerek hypothalamusában. A vér-agy gátban megtalálható α-DB kimutatását egyéb szöveti gátakat képző szervekben, mint a herében és a tüdőben is elvégeztük egérben, ultrastrukturális szinten. Az α-DB a herében a vér-here, a tüdőben a vér-levegő gát egyes elemeiben jelent meg. A herében az α-DB-t a Sertoli sejtek plazmamembránjának alaphártyával érintkező és a csírasejtek felé néző részén, tüdőben az alveolusok falát felépítő 1-es típusú alveoláris epithel sejtek citoplazmájában detektáltuk. Összefoglalva, kísérleteink alapján elektronmikroszkópos bizonyítékot szolgáltattunk a Dp71f disztrofin izoforma megjelenésére szinapszisok posztszinaptikus denzitásban és egy olyan sejtkompartmentben (axonokban), ahol eddig disztrofin fehérjéket még nem mutattak ki. A vad típusú és disztrofinhiányos egerek agyi ereivel kapcsolatos eredményeink új ismeretekkel szolgálnak az erekben felépülő DAPC -re vonatkozóan. Az α-DB2/α-DB4 neuronális lokalizálása az irodalomban eddig nem szereplő, teljesen új eredmény. A DAPC fehérjékkel és neuropeptidekkel kapcsolatos eredményeink remélhetően jövőbeli kutatások alapjaként szolgálhatnak. A herében és a tüdőben általunk leírtak hozzájárulnak a vér-here és a vér-levegő gátban lévő DAPC sejt- és molekuláris szintű felépítésének tisztázásához.