Különböző állatfajokból származó Pasteurella multocida törzsek jellemzése tradicionális és molekuláris módszerekkel

Abstract

A P. multocida-t, mint feltételes (fakultatív) kórokozót már több mint 100 éve ismerjük, de kórokozó mechanizmusai, gazdafaj-adaptációs tényezői a mai napig nem tekinthetők tisztázottak. Ennek egyik oka a mellőzöttség lehet, mely a feltételesen kórokozó sajátságokra és ennek megfelelően az okozott betegségek diszpozíciós jellegére vezethető vissza, másrészt pedig az a fokozott feno-, és genotípusos heterogenitás, mely szinte minden tanulmány során elrejti az érdemi összefüggéseket a vizsgálódó szeme elöl. Vizsgálataink általánosan összefoglalható célja az volt, hogy a törzseket jellemző változatosságon belül próbáljunk törvényszerűségeket kimutatni, mivel egyedül a megfelelő rendező elv felismerése teheti lehetővé a P. multocida populáción belül létező törzscsoportok körülhatárolását, melyek mind patogenitásukban, mind gazdafaj-specificitásukban elkülönülhetnek egymástól. Az e törzscsoportokon belüli célzott vizsgálatok ugyanis minden bizonnyal a korábbiaknál egyértelműbb eredményeket adnak majd a P. multocida virulencia és gazdafaj-adaptációs tényezőinek felismerése és azok célszerű diagnosztikai és oltóanyag-termelési hasznosítása tekintetében. Ennek megfelelően vizsgálataink során első lépésében az emlős- és baromfi-eredetű törzsek fermentációs sajátságait elemeztük, összesen 14 tápanyagforrást figyelembe véve. Feltártunk néhány jellemző jegyet, mint pl. az egyes emlős-eredetű törzseket jellemző ornitin-dekarboxiláz termelő képesség hiányát, a csökkent indoltermelést bizonyos nyúleredetű törzsekben, vagy a laktóz fermentáló képesség megjelenését adott sertés-eredetű törzsek esetén. A szintén fermentációs-bélyegek alapján meghatározott alfaji kategóriák közül a P. multocida subsp. multocida dominanciája egyértelműen megmutatkozott. Az alfajok és a gazdafajok, illetve a megbetegedések súlyossága között nem tudtunk egyértelmű összefüggést kimutatni. Eredményeink felhívták azonban a figyelmet az egyes gazdafajok hasonló tulajdonságú P. multocida törzsekkel szembeni eltérő érzékenységére. A továbbiakban a törzsek antigenitási sajátságainak megoszlását vizsgáltuk. A P. multocida esetében a különböző buroktípusok előfordulásának nagy jelentőséget tulajdonítanak a gazdafaj-adaptációban. Munkánk során – a gazdafajtól függetlenül - az A buroktípus előtérbe kerülését tapasztaltuk. A D buroktípusú törzsek aránya ugyanakkor csökkent a sertés-, míg az F buroktípusúaké nőtt a nyúl-gazdafajokban. Összességében azonban a buroktípusok törzscsoport elkülönítő szerepének csökkenését tudtuk kimutatni. További vizsgálatainkat csak baromfi-eredetű törzseken végeztük el, mert így lehetőségünk volt az azonos karakterő, de különböző gazdafaj-eredetű törzsek összehasonlító vizsgálatára. A törzsek antigenitási sajátságait szerológiai próbákkal is kiegészítettük, mivel a baromfi-eredetű törzsek buroktípus tekintetében nagymértékű 9 homogenitást mutattak (A buroktípus 93,5%). A szerológiai eredmények elsősorban a patogenitással összefüggő csoportosításra adtak lehetőséget. Dominánsan az A:1 és A:3 szerotípusú törzsek fordultak elő. Közülük a feltehetőleg fokozott virulenciával rendelkező törzseket az A:1, a mérsékelt virulenciájúakat az A:3 törzsek képviselték. Egyedi szerotípusok csak a pulyka-eredetű törzsek között fordultak elő. A P. multocida a legtöbb forgalomban lévő antibiotikummal szemben érzékeny. Antibiotikum-rezisztencia a törzsekben elsősorban csak más baktériumfajoktól felvett mechanizmusok révén jön létre. Az antibiotikum-rezisztencia vizsgálatokkal a P. multocida törzsek genetikai változékonyságára való fogékonyságát kívántuk jellemezni. A törzsek 54%- a rendelkezett valamilyen antibiotikum-rezisztenciával. Leggyakrabban a nalidixsav és a szulfonamid származékokkal szembeni rezisztenciát tapasztaltuk. A multirezisztens törzsek 82%-a az A:1 szerotípusba tartozott. A törzsek rokonsági viszonyainak feltérképezésére molekuláris módszereket alkalmaztunk. Az ERIC-PCR módszerrel generált fenogram törzscsoportok elkülönülését mutatta, mind gazdafaj- (tyúkalkatúak; récefélék; pézsmaréce), mind földrajzi-eredet tekintetében. Az egyes törzscsoportokon belül az A:1 és A:3 szerotípusú törzsek típusazonos törzsekkel való összetartozása volt megfigyelhető. A kialakult törzscsoportok további jellemzésére egyedi génvizsgálatokat végeztünk el. Öt különböző fehérjét kódoló génszakaszt (az A burok-specifikus(hyaDC), három külső membrán (oma87, ompA, ompH) és a 4-es típusú fimbria kisalegység (ptfA)-hofB) PCRRFLP vizsgálatnak vetettük alá. Az ompA és ptfA-hofB génszakasz a pézsmaréce-eredetű törzsek a többi baromfiból származó törzstől való elkülönülését erősítette meg. Az ompH génszakaszon tapasztalt különbségek a törzsek szerológiai sajátságaival mutattak összefüggést, de azok egyértelmű molekuláris megkülönböztetését nem tették lehetővé. Ellenben az A:1 és egyes egyedi szerológiájú pulyka-eredetű törzsek esetén egységes mintázatot adott. Harminckét törzs ptfA génszekvencia vizsgálata a gén 3’ végi régiójában számos nukleotid konzervatív cseréjét jelezte, ami két alléltípus (A és B allél) elkülönítését tette lehetővé. A két típus egyszerű megkülönböztetésére allél-specifikus PCR-t hoztunk létre. Ennek használatával kimutattuk, hogy az A:1 szerotípusú törzsek dominánsan az A alléltípust hordozzák, a B alléltípus jelenléte az egyéb szerotípusú törzsekre volt jellemző. Vizsgálataink igazolták, hogy a P. multocida populáció, mind gazdafaji, mind patogenitási szempontból elhatárolódó törzscsoportokból épül fel, melyek elkülönítéséhez a feno-, és genotípusos bélyegek széles körű vizsgálata szükséges. Igazoltnak látjuk továbbá a célmeghatározás során a fentiekben kifejtett azon véleményünket, hogy a törzscsoportok meghatározása, további jellemzése elengedhetetlen a P. multocida törzsek jövőbeni sikeres vizsgálataihoz és az ismeretek gyakorlati hasznosításához.

High degree of genotypic and phenotypic diversity is characteristic of Pasteurella multocida. Studying of sorting rules within this heterogenicity ensures delineation of unique groups of related strains. Detailed observations of these groups of strains provide the opportunity of thoroughly studying the virulence and host-adaptation factors of P. multocida. Examination of phenotypic characters of P. multocida isolated from mammals (221 strains) and poultry (61 strains) showed the presence and co-occurrence of certain strains with well-characterized biochemical features. P. multocida is divided to three subspecies (subsp. multocida, subsp. septica, subsp. gallicida). In our study, P. multocida subsp. multocida was dominant among strains isolated both from mammals and poultry. A definite correlation between subspecies, host and severity of diseases caused by P. multocida could not be detected. Different capsule types of P. multocida may have a role in host-adaptation. Our results demonstrated that capsule type A is becoming dominant independently from the host. At the same time, the number of strains with capsule type D decreased in swine and strains with capsule type F increased in rabbits. The serological typing showed that the majority of strains isolated from poultry belonged to serotype A:1 and A:3. Few unique serotypes (F:4,5,[7]; F:10) occurred only among strains from turkey. Serotype A:1 strains might represent a virulent type while serotype A:3 may be a moderately virulent type. The antimicrobial resistance pattern of P. multocida is pointed to the sensitivity of strains to genetic changes. Fifty-four percent of strains isolated from poultry possessed resistance to at least one of the antimicrobial agents tested in our study. Most of them (82%) were multi-resistant. The resistance to nalidix-acid and sulphonamides was the most frequent. With ERIC-PCR, we could delineate groups of strains separated according to host (Muscovy duck, galliformes, anseriformes) and geographic origin. Serotype A:1 and A:3 strains showed relation with strains with similar serotype. The groups of strains was further characterised with PCR-RFLP on genes (hyaDC, oma87, ompA, ompH, ptfA-hofB) encoding surface localized proteins. The gene region of ompA and ptfA-hofB indicated separation of strain isolated from Muskovy duck from other strains from poultry. PCR-RFLP of ompH gene region showed considerable diversity that harmonized with the presence of certain serotypes. Serotype A:1 strains and strains with unique serotypes isolated from turkey could be separated by their uniform PCR-RFLP patterns. 11 The sequence analysis of ptfA gene of 32 strains from poultry identified consensus nucleotide changes in the 3’-end region. These differences on the sequence defined two alleles of ptfA gene (allele A and B). For rapid identification of these alleles we developed an allele-specific PCR assay that demonstrated the dominancy of allele A in serotype A:1 strains while allele B was typical for the other serotypes. Our experiments proved that P. multocida population consists of groups of strains separated either by the origin of host or their pathogenicity.