Polymerase chain reaction-based investigations of canine distemper and parvovirus strains from Hungary

Abstract

Samples taken from various species from 2004 to 2008 were analyzed for the presence of canine distemper virus (CDV), type 2 canine parvovirus (CPV2), or feline panleukopenia virus (FPV). The samples were collected from animals showing signs of clinical illness (clinical samples), or were collected from animals that succumbed following clinical signs suggestive of a viral infection, or when pathological changes indicative of such a disease were found during necropsy (necropsy samples). In case of clinical samples, the diagnosis was based on various molecular techniques applying polymerase chain reaction (PCR) based techniques, while in case of succumbed animals a wide spectrum of diagnostic methods was employed, such as macroscopic and routine light microscopic investigations, electron microscopy, and PCR-based techniques concluding with nucleic acid sequencing and subsequent phylogenetic analysis. The genetic analysis of Hungarian CDVs revealed the presence of strains belonging to several lineages: European, Arctic and European wildlife. The virus strains clustered in the Arctic group of CDVs were also demonstrated to be responsible for the endemic infection at the Dog Shelter of the City Council of Budapest. On the other hand, CDV infection was demonstrated in several other species from Hungary: fox (Vulpes vulpes), raccoon (Procyon lotor) and ferret (Mustela putorius furo). A restriction fragment length polymorphism (RFLP) assay was also developed for the fast differentiation of vaccine and wild-type CDVs. The practical trials of the PsiI-based RFLP revealed that the virus strain present in one of the currently used vaccines reacted as a wild-type strain. Following the diagnostic PCR reactions, out of the 214 analyzed samples 58 (27.1 %) proved to be positive for CDV. Based on the subsequent nucleic acid sequencing and phylogenetic analysis, the incriminated strain was not clustered in the group of vaccine strains (America-1), as expected based on the product description provided by the manufacturer, but it was more closely related to pathogenic strains of different geographical origins. Vaccine batches of the same manufacturer were purchased in different countries (Israel, Malta, and USA), and batches dating back to 1992 and 1994 were also included in the analysis. The genetic analyses revealed that all these batches contained the exact same virus strains as the Hungarian vaccines purchased in 2006. Parvovirus (FPV/CPV2) genetic material was successfully demonstrated by PCR in 72 (31.3 %) out of the 230 analyzed samples (in 17 cats, 1 lion, 1 Asian palm civet and 53 dogs). The initial genotyping attempts of 20 type 2 canine parvovirus (CPV2) strains from Hungary, using a previously described MboII-based RFLP test, revealed that 8 many of them were type 2c CPVs. Based on the subsequent nucleic acid sequencing, all Hungarian CPV2 strains turned out to be type 2a CPVs. The explanation of the initial misleading results was a point mutation that occurred at the other end of the amplicons used for the enzymatic digestion, emphasizing the need to constantly improve fast genotyping techniques and the fact that initial results can be misleading and they have to be double-checked using a more reliable technique. The work also presents the first direct demonstration of a feline parvovirus (FPV) infection in an Asia palm civet (Paradoxurus hermaphroditus). The pathological changes induced by the infection were similar to those described in other species, but the result emphasizes the fact that the host range of FPV is even wider than it was thought, and it includes even members of the Viverridae family. FPV infection was also demonstrated in a lion (Panthera leo) that belonged to a Hungarian lion tamer. The subsequent genetic analysis of the Hungarian FPV strains from the Asian palm civet, lion and two cats (Felis catus) revealed that there is relatively heterogenic group of FPV strains currently circulating in Hungary.

Vizsgálataink során 2004 és 2008 között, különbözı állatfajokból származó mintákban szopornyicavírus (canine distemper virus: CDV), 2-es típusú kutya parvovírus (canine parvovirus 2: CPV2) vagy macska panleucopaenia vírus (feline panleukopenia virus: FPV) kimutatását kíséreltük meg. A minták klinikai tüneteket mutató (klinikai minták), illetve vírusos fertızésre utaló klinikai megbetegedést követıen elhullott állatok szerveibıl (szervminták) származtak. A klinikai minták esetében a diagnózist polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction: PCR) alapú molekuláris biológiai módszerek segítségével állítottuk fel, míg az elhullott állatok esetében széleskörő diagnosztikai vizsgálatokat alkalmaztunk, mint például makroszkópos vizsgálatot (boncolás), kórszövettant, elektronmikroszkópos vizsgálatot, PCR-alapú módszereket, illetve nukleinsav- és aminosav-szekvencia meghatározást és filogenetikai analízist. A PCR reakciók alapján a vizsgált 214 minta közül 58 (27,1 %) CDV pozitívnak bizonyult. A genetikai vizsgálatok során több CDV csoportba („európai”, „északi-sarki” és „európai vadvilág”) tartozó vírustörzset sikerült kimutatni Magyarországon. Az északi-sarki csoportba tartozó vírustörzsek a Fıvárosi Ebrendészeti Telepen kimutatott endémiás fertızésért bizonyultak felelısnek. Ugyanakkor szopornyicát több állatfajban is sikerült kimutatni: rókában (Vulpes vulpes), mosómedvében (Procyon lotor) és vadászgörényben (Mustela putorius furo). A vakcina-eredető és vad CDV törzsek gyors elkülönítése érdekében restrikciós fragmentumhossz polimorfizmus (restriction fragment length polymorphism: RFLP) alapú eljárást dolgoztunk ki. A PsiI alapú RFLP eljárás gyakorlati alkalmazása során az egyik jelenleg Magyarországon is alkalmazott CDV fertızés elleni vakcinában található vírustörzs a vad vírustörzsekkel azonos reakciót eredményezett. A nuklein- és aminosav szekvenciák és a filogenetikai vizsgálat alapján a Vanguard (Pfizer Animal Health, USA) vakcinában található vírustörzs nem a vakcina-vírusok csoportjába, mint az a gyártó által közzétett leírás alapján elvárt volt, hanem sokkal nagyobb genetikai hasonlóságot mutatott különbözı földrajzi régiókból származó vad vírustörzsekkel. Következı lépésként több országból (Izrael, Málta, USA) származó Vanguard vakcinát, valamint 1992-bıl és 1994- bıl származó vakcinákat vizsgáltunk meg. A genetikai vizsgálat alapján mindegyik vizsgált Vanguard vakcinában ugyanaz a vírustörzs volt jelen, mint a 2006-ban vizsgált magyarországi vakcinában, és semmiképp sem az, amit a gyártó a termékleírásban feltüntetett (Snyder Hill törzs). 10 Az FPV és CPV2 együttes kimutatására alkalmas klasszikus PCR-alapú eljárás segítségével a vizsgált 230 minta közül 72 (31,3 %) pozitívnak bizonyult (17 macska, 1 oroszlán, 1 pálmasodró és 53 kutya eredető minta esetében). Egy korábban leközölt MboII alapú RFLP vizsgálat alkalmazását követıen 20 magyarországi CPV2 törzsbıl 15 esetében CPV2c genotípusú törzseknek megfelelı eredményt kaptunk. A nuklein- és aminosav szekvenciák vizsgálata alapján az összes vizsgált magyarországi törzs tulajdonképpen 2a típusú CPV-nak bizonyult. A félrevezetı eredmény magyarázata a PCR során keletkezett amplikonok másik végén létrejött pontmutációban rejlik. Ennek következtében a 20 magyarországi törzsbıl az RFLP alapú eljárást követıen 15 esetében félrevezetı genetipizálási eredményt kaptunk. Ez a tény a gyors genotipizálási technikák folyamatos felülvizsgálatának, illetve az eredmények megbízhatóbb eljárások segítségével történı alátámasztásának szükségességét emeli ki. Vizsgálataink során elsıként sikerült direkt eljárásokkal kimutatni FPV fertızést egy cibetmacskafélében (Viverridae). A megvizsgált ázsiai pálmasodróban (Paradoxurus hermaphroditus) keletkezett kórbonctani és kórszövettani elváltozások megegyeztek az FPV által más állatfajokban elıidézett elváltozásokkal. Ugyanakkor a fertızés sikeres kimutatása fényt derített arra is, hogy a kórokozó gazdaspektruma szélesebb az eddig ismertnél, és hogy az FPV iránt a cibetmacskafélék is fogékonyak. FPV fertızést egy Érd mellıl származó oroszlánban (Panthera leo) is sikerült kimutatni. Az ázsiai pálmasodróban, az oroszlánban és két macskában kimutatott vírustörzsek genetikai vizsgálatának eredménye arra enged következtetni, hogy a jelenleg Magyarországon cirkuláló FPV törzsek viszonylag heterogén csoportot alkotnak.