Vírusos baromfibetegségek molekuláris diagnosztikája, különös tekintettel a csirkék fertőző nephritisét okozó vírus kimutatására és különböző törzseinek genetikai összehasonlító vizsgálatára

Abstract

Az avian nephritis vírus okozta kórkép a baromfi egy kevéssé vizsgált, de széles körben elterjedt, gazdaságilag jelentős fertőző betegsége, amely makroszkóposan is felismerhető morfológiai elváltozásokat hoz létre. A baromfiállományok állatorvosi felügyelete során gyakran tapasztalható heveny veseelégtelenségből, illetve köszvényből adódó tömeges elhullás, azonban a kiválasztás jellegzetességei miatt számos oka lehet ilyen veseelváltozás létrejöttének. A tanszékünkre bekerülő napos baromfi hullaanyag vizsgálata során felmerült egy vesekárosító fertőző ágens esetleges jelenlétének, a néhány országban már leírt avian nephritis vírus okozta fertőzésnek a gyanúja. Ez a gyanú alapozta meg a specifikus diagnosztika iránti igényt, az egyéb más okok által előidézett köszvénytől való elkülönítést, és az avian nephritis vírus jelenlétének megerősítését vagy kizárását. Mivel a köszvényes elváltozást mutató hullák egy részének kórbonctani és kórszövettani diagnosztikai vizsgálatával egyértelműen vírusos megbetegedésre utaló elváltozásokat állapítottunk meg, kiegészítő transzmissziós elektronmikroszkópos vizsgálatot végeztünk, amely során kb. 28 nm nagyságú, öt- vagy hatágú csillagra emlékeztető alakú, ikozaéder felépítésű nukleokapsziddal rendelkező, burok nélküli virionok jelenlétét mutattuk ki a tubuláris hámsejtekben, ami ANV fertőzés okozta vesekárosodásra utalt. A génbankban közölt teljes ANV genomszekvencia (NC_003790) alapján az 5' nem kódoló régióra primereket terveztünk. A specifikus, reverz transzkripciót követően polimeráz láncreakció (RT-PCR), majd egy nested PCR segítségével a referencia törzsön kipróbáltuk és optimalizáltuk a reakciót. Az állat-egészségügyi diagnosztikai intézetekben őrzött korábbi vizsgálati anyagokban, valamit számos, nephritisben szenvedő csirkeállományban vizsgáltuk az ANV jelenlétét. A képződött, 816 bázispár hosszúságú terméken direkt nukleinsavszekvencia meghatározást hajtottunk végre. A kapott nukleinsav szekvencia a legnagyobb, 92%-os hasonlóságot az ANV-hoz mutatta, ezzel igazoltuk, hogy az amplifikált termék valóban a mintában jelenlévő vírus nukleinsav alapján képződött (Mándoki és mtsai, 2006b). 2002 és 2005 között különböző baromfitartó telepekről behozott, különböző korú, fertőzöttségre gyanús hullákból elsősorban vese- és vékonybél-mintákat gyűjtöttünk, amelyeket állományszintű szűrővizsgálatra keverten, részletes szervi vizsgálatra egyedenként homogenizáltunk és RNS-t tisztítottunk belőlük. Az így létrehozott és megvizsgált mintacsoportokból gyűjtöttük a pozitív eseteket. Mivel a későbbiek során a nagyobb specifikusságú és érzékenységű rendszert fejlesztettünk ki, és kedvezőbb primertapadási helyeket sikerült azonosítani, új primereket 7 szintetizáltattunk a vírus ORF1 régiójára, amelyet a további szűrővizsgálatokban alkalmaztunk. A képződött, 607 bázispár hosszúságú termékeken újabb direkt nukleinsavszekvencia meghatározást hajtottunk végre. További pozitív PCR termékek szekvenálásával filogenetikai analízist végeztünk (Mándoki és mtsai, 2006a), amellyel bebizonyítottuk, hogy a magyarországi ANV törzsek a vizsgált szakaszon meglepően nagy eltérést (76-86%) mutatnak a referencia törzstől, sőt egymástól is. Ez az eltérés nemcsak különböző telepekről származó mintákra, hanem adott esetben egy gazdaságban nevelt, különböző korú baromfiból származó mintákra is igaznak bizonyult. A módszer segítségével több hazai csirkeállományban igazoltuk a vírus jelenlétét, és az adatokat felhasználva felmértük a vírus által okozott kórkép hazai elterjedtségét (Mándoki és mtsai, 2005). Vizsgálataink eredményei alapján a fertőzöttség országszerte előfordul, és a kórkép valószínűleg gyakrabban áll egyes csirkeállományok nem megfelelő fejlődésének hátterében, mint korábban vélhető volt. A fentiekben leírt, és elsősorban alapkutatás jellegű laboratóriumi vizsgálatok gyakorlati munkában is hasznosítható eredménye az volt, hogy kialakítottunk egy olyan, a további diagnosztikai szűrővizsgálatok számára is felhasználható, gyors, megbízható PCR módszert, amely – a vírus meglehetősen nagy változékonysága ellenére is – képes a fertőzöttség kimutatására, ezáltal lehetőséget teremt a jövőben az avian nephritis vírus hazai elterjedtségének feltérképezésére, a kórokozó megbetegítő képességének vizsgálatára és a magyarországi vírustörzsek további jellemzésére. Emellett ez az RNS vírus – magas mutagenitása alapján – modellként szolgálhat a vírusevolúció tanulmányozásában, amit a rövid, jól kezelhető, viszonylag olcsón végigszekvenálható genom is segít.

Avian nephritis (AN) is a widely distributed viral kidney disease of newly hatched chickens resulting in well recognizable macroscopic lesions. Poultry is prone to develop uricosis, so it is often diagnosed as cause of death. There are several non-infectious and also infectious causes classified in the aetiology of uricosis. PM examination of young chickens sent to the Department of Pathology and Forensic Veterinary Medicine indicated that the diagnosed tubulonephrosis and interstitial nephritis might be of viral origin, most probably ANV. As any condition which results in nephropathy and renal failure leads to gout, the differential diagnosis of ANV became essential. The aim of this thesis work was to prove the presence of the avian nephritis virus in Hungary and to develop a fast and reliable method to diagnose ANV in samples sent to our laboratory from different farms experiencing high losses. In order to detect Avian Nephritis Virus (ANV), kidney samples from chickens diagnosed with acute nephritis and gout were subjected to histopathologic and electron microscopic examination. The EM examination revealed the presence of small round, nonenveloped virions of 28-31 nm in diameter in the tubular epithelial cells with the characteristic five-pointed or six-pointed star-like morphology of the icosahedral capsid. ANV-specific primer pairs were designed on the 5’ non-structural region of the reference strain (GeneBank accession number NC_003790). An RT-PCR assay followed by a nested reaction was developed. After the optimalization of the PCR reaction on the reference strain, other kidney samples were also screened. The reactions resulted in distinct products with the previously calculated size, 816bp after the RT-PCR and 325bp after the nested RTPCR reaction. The nucleotide sequence of the 816bp long amplicon was determined. It has shown the highest identity with the nucleotide sequence of the targeted genome region of ANV in BLAST search. The sequence was aligned with the complete ANV genome, exhibiting 92% identity between the Hungarian genotype and the GP1 genome section of the reference virus strain. Between 2002 and 2005 numerous kidney and intestine samples were collected from chickens of different age from different Hungarian flocks showing the special pathological changes. The samples were pooled for screening or stored individually for particular organ examinations, then homogenized for subsequent RNA extraction/purification. The PCR resulted in a detection of a specific product in several samples from Hungarian flocks. 83 To shorten the time necessary for the diagnosis and to minimalize the possibility of contamination, a fast and reliable ANV specific RT-PCR based detection method without a nested step has been developed with a new primer pair positioned on the ORF1. The nucleotide sequence of the new, 607bp long amplicons was determined and aligned. Several positive samples were used in a phylogenetic analysis, showing high divergence (76-86%) from each other and the reference strain. Using this test we proved the presence of the avian nephritis virus in several Hungarian flocks (Mándoki et al., 2005) and the results of the screening helped to clarify the occurrence of this viral disease. According to our data the infection is widely distributed in the Hungarian flocks, and the avian nephritis virus infection might more often be the reason for the improper breeding results in chicken industry, than diagnosed. This ANV specific RT-PCR based detection method can not only be used for research purposes, but on the other hand it is a quick, specific and reliable screening method for the diagnosis of the disease even in case of this highly mutagenic RNA virus. Further investigations can be performed to identify the distribution of ANV in Hungary, the connection between the nephritis and the presence of the virus, virulence and genetic diversity of the different ANV strains. The phylogenetic analysis of more ANV isolates might allow a better understanding of the virus evolution, as the sequence analysis of this genome, which is relatively small, and easy to handle easily manageable is possible at small expenses.