Epidemiological study of viral pathogens incriminated in enteric disease complexes in Hungarian broiler flocks, with special emphasis on the newly identified parvovirus

Abstract

Samples collected between 2007 and 2010 from chicken and turkey carcasses, originating from Hungarian commercial flocks with clinical signs of enteric disease (ED), increased mortality and poor production parameters, were tested by histopathology, indirect immunohistochemistry (IHC), electron microscopy andmethods applying polymerase chain reaction (PCR) techniques, with the goal of determining the epidemiology and pathogenesis of the ED syndrome. PCR and reverse transcription PCR (RT-PCR) were employed to directly demonstrate viral pathogens currently associated with ED syndromes in chickens and turkeys: astroviruses, reoviruses, rotaviruses, coronaviruses, adenoviruses and parvovirus. Among the objectives of this study was to directly demonstrate the presence of the scarcely known chicken parvovirus (ChPV) and turkey parvovirus (TuPV) in Hungarian chicken and turkey flocks experiencingclinical signs of ED. ChPV and TuPV infection was demonstrated in 15 chicken and 25 turkey flocks. The histopathological investigation revealed enteritis in the duodenum and jejunum, and atrophy of the lymphoid organs. The work also presents an indirect IHC method for the diagnosis of ChPV and TuPV. The results obtained by indirect IHC suggested the intestinal epithelium of chickens and turkeys as a potential replication site for theviruses, similarly to other parvoviruses, while in case of the turkey samples, IHC positivitywas also observed in the bursa of Fabricii, liver and pancreas. Phylogenetic analysis on a 524 base pairs (bp) longregion from the NS1 gene of the ChPV strains, and 527 bp long region from TuPV strains respectively, revealed two main clusters, a ChPV and a TuPV group, but also the presence of a divergent branch of tentatively named “TuPV-like ChPV strains”. The 23 Hungarian TuPV strains were positioned separately from the American origin sequences in the TuPV cluster, in two groups, while the 15 Hungarian ChPV strains did notpresent any specific grouping. A restriction fragment length polymorphism (RFLP) assay was developed for the fast differentiation of TuPV, ChPV and divergent, TuPV-like ChPV strains. The differences between the AvaIIdigestion pattern of parvovirus strains belonging to the TuPV, ChPV and TuPV-like groups, seem to provide a quick and reliable differentiation of all these strains without the need for nucleic acid sequencing. In the future, the newly described protocol could be used to rapidly obtain valuable epidemiological data, and will turn out to be even more practical in case potential differences in thepathogenicity of these strains should be revealed by future pathogenesis studies. A high number of Hungarian chicken broiler flocks were determined to be coinfected with avian nephritis virus (ANV), infectious bronchitis virus (IBV) and infectious bursal disease virus (IBDV). Due to the high prevalence of this coinfection, a diagnostic method based on a multiplex RT-PCR (mRT-PCR) assay was also developed in this study for the direct demonstration in field samples of ANV, IBV and IBDV. A total of 28 chicken flocks and 51 turkey flocks from distinct geographical regions of Hungary, were investigated by direct methods forthe presence of viral pathogens incriminated in ED, with the goal of determining the epidemiology and pathogenesis of the syndrome. By including a broad range of viral agents in the determination, we are confident that the present study contributes in clarifying the epidemiology of a current economic threat for the poultry industry, the ED syndrome, with the potential of being useful for to the elaboration of comprehensive preventive measures, to avoid in the future the serious losses that the poultry industry is suffering due to this syndrome.

Kutatásaink során enterális kórkép (enteric disease: ED) tüneteit mutató, fokozott elhullással és nem megfelelő takarmányhasznosítási paraméterekkel küszködő állományok csirke és pulyka tetemeiből származó, 2007 és 2010 között gyűjtött mintákat kórszövettani, immunhisztokémiai, (IHC) elektronmikroszkópos és polimeráz láncreakció (PCR) alapú vizsgálatnak vetettük alá, a korábban említett ED kórkép járványtanának és kórfejlődésének vizsgálata és jobb megismerése céljából. A PCR-alapú eljárások segítségével az ED kórkép csirke- és pulykaállományokban történő kialakulásával szoros összefüggésbe hozott vírusos kórokozók, pontosabban astrovírusok, reovírusok, rotavírusok, coronavírusok, adenovírusok és parvovírusok kimutatását kíséreltük meg. Vizsgálataink további célja a kevésbé ismert csirke és pulyka parvovírus (chicken parvovirus: ChPV, illetve turkey parvovirus: TuPV) kimutatása volt ED tüneteit mutató magyarországi csirke- és pulykaállományokban. ChPV és TuPV fertőzést 15 csirke- és 25 pulykaállományban sikerült igazolni. A pozitív állományokból származómintákban a kórszövettani vizsgálat során vékonybélgyulladást és a lymphoid szervek sorvadása volt megfigyelhető. Vizsgálataink során a ChPV és TuPV kimutatására alkalmas IHC eljárás kidolgozására is sor került. Az újonnan kidolgozott IHC eljárás alapján a többi parvovírushoz hasonlóan, a ChPV és TuPV multiplikációja nagy valószínűséggel a csirke és pulyka bélhámsejtjeiben zajlik. A pulyka eredetű minták esetében IHC pozitivitás a Fabricius-tömlőben, a májban és a hasnyálmirigyben is megfigyelhető volt. A ChPV törzsek esetében az NS1 gén 524 bázispár (bp), míg a TuPV törzsek 527 bp hosszú szakaszán végzett filogenetikai vizsgálatalapján a vírustörzsek két, jól elkülönülő, ChPV illetve TuPV csoportba rendeződtek, ugyanakkor a filogenetikai fán egy külön ágon helyeződő, „TuPV-szerű ChPV” törzsek csoportja is felismerhető volt. A 23 magyarországi minta a TuPV csoport két alcsoportjába rendeződött, az amerikai eredetű mintáktól elkülönülve, míg a 15 magyarországi ChPV törzs esetében semmilyen jellegzetes csoportosulás nem volt megfigyelhető. A restrikciós fragmentumhossz polimorfizmus (restriction fragment length polymorphism: RFLP) alapú eljárást a TuPV, ChPV, illetve a TuPV-szerű ChPV törzsek gyors elkülönítése céljából dolgoztuk ki. A TuPV, ChPV, illetve TuPV-szerű ChPV törzsek estében kapott PCR termékek különböző AvaII hasítási tulajdonságai alapján az ezekbe a csoportokba tartozó törzsek nukleinsav-szekvencia meghatározása nélkül is gyorsan, megbízható módon elkülöníthetők. Az újonnan kidolgozott RFLP alapú eljárás a jövőben nagy segítséget nyújthat a járványtani felmérésekben, főleg abban az esetben, főleg ha a későbbiekben a különböző törzsek pathogenitásában különbségek megállapítására sor kerül. A magyarországi brojlerállományok vizsgálata során számos esetben igazoltuk az állományok a csirkék fertőző vesegyulladásának vírusával (avian nephritis virus: ANV), a fertőzőbronchitis vírusával (infectious bronchitis virus:IBV), illetve a fertőző bursitis vírusával (infectious bursal disease virus: IBDV) történő egyidejű fertőződését. Az egyidejű fertőzések viszonylag nagy gyakorisága következtében az említett kórokozók klinikai, vagy szervmintákban történő gyors és megbízható kimutatásának céljából egy multiplex RT-PCR (mRT-PCR) alapú diagnosztikai eljárást dolgoztunk ki. Összesítve, vizsgálataink során Magyarország különböző földrajzi régióiban található 28 csirke- és 51 pulykaállományból származó mintákat vizsgáltunk az ED kórképben szerepet játszó vírusos kórokozók kimutatása céljából. Meggyőződésünk, hogy a számos kórokozóra kiterjedő vizsgálataink eredményei hozzájárulnak a baromfiállományokban fokozott gazdasági veszteségeket okozó kórkép járványtanának és kórfejlődésének jobb megismeréséhez, és ezáltal hozzájárul a kórkép által okozott veszteségek megelőzéséhez szükséges intézkedések feltárásában.