Terápiarezisztencia fehérjék működésének vizsgálata "Flowcytometria" alkalmazásával daganatos kutyák nyirokcsomó mintáiban

Abstract

A „flow”, vagy áramlás citometria lényege, hogy folyadékfázisban ultravékony tubusban áramló sejteket lézerfény segítségével világítjuk meg, és a fénytörésük jellemzői alapján számítógép segítségével virtuálisan el tudjuk különíteni őket egymástól. Így hasonló tulajdonságú sejteket a más tulajdonságú sejtektől elkülönítetten tudjuk vizsgálni. Ilyen műszer alkalmas a rutin hematológiai vizsgálatok elvégzésére, de más célból is használható. Ha a sejteket immunológiai módszerrel fluoreszkáló anyag kapcsolásával jelöljük, akkor az adott sejt fluoreszkáló tulajdonsága megváltoztatja a lézerfény törését, így a sejt elkülönítetten vizsgálható. Ez az ún. FACS (fluorescence activated cell sorting) eljárás. Ez a módszer alkalmas arra, hogy a sejtek membrántranszporter funkciója vizsgálható legyen. Ha a sejtekhez fluoreszkáló molekulát (calcein) adunk és inkubáljuk, akkor ez az anyag a sejtekbe jut. Amennyiben a sejt rendelkezik membrántranszporter fehérjékkel (P-glükoprotein /Pgp/, multidrug resistance associated protein-1 /mrp1/) és ún. „multidrug” rezisztencia funkcióval, akkor a calceint a sejtek kipumpálják magukból. Munkánk során azt vizsgáltuk, hogy a kemoterápiás kezelésben részesülő 12 lymphomás és 6 egyéb daganatos betegek daganatsejtjeinek membrántranszporter funkciója között van-e különbség. A kutyák nyirokcsomójának, illetve szövetszaporulatainak lymphoid sejtjeit szeparáltuk, majd azok egy részét membrántranszporter gátló anyag hozzáadása nélkül calcein-nel inkubáltuk, egy másik részéhez 50μM-os verapamil-t adtunk, amely a Pgp és az mrp1 gátlója, harmadik részéhez ún. MK571 molekulát adtunk, amely az mrp1 gátlója, negyedik részéhez 10μM-os verapamil-t adtunk, amely az MDR1 /Pgp/ gátlója. Végül a három gátlóanyagot tartalmazó sejtszuszpenzióhoz is calceint adtunk. A FACS vizsgálat során mértük a sejteken belüli fluoreszcenciás aktivitás mértékét. Agátlás nélküli és a gátlóanyagokat tartalmazó sejtek eltérő fluoreszcenciás aktivitásának kifejezéséhez kiszámítottuk az ún. MAF-(multidrug rezisztencia aktivitási faktro-) értékeket. Ezek jelzik a sejtek Pgp és mrp1 funkcióját.

Principles of flow cytometry is the illumination of cells by laser light, which are flowing in an ultrathin tube. These cells can be separated virtually according to their light scattering by computerised technique. Thus the similar cells can be examined separately from cells with other character. Such an instrument is suitable for routine haematology examinations, but can be used for other purposes. If the cells are signed with fluorescent molecules by immunological methods, the cell will change its light scattering, so it can be examined separately. This called as FACS (fluorescence activated cell sorting). This method can be used to detect the membrane transporter function of the cells. If we add fluorescent molecule (calcein) to the cells, and incubate them, then this molecule will penetrate into the cells. If the cells have membrane transporter proteins (P-glycoprotein /Pgp/, multidrug resistance associated protein-1 /mrp1/) and multidrug resistance function, than the cells will efflux calcein. In our study we were interested in whether the membrane transporter function of separated lymphoid cells of 12 dogs with lymphoma receiving chemotherapy is different from the same function of lymphoid cells of 6 dogs with other tumors. Lymphoid cells from lymphonodes samples of dogs were separated into four parts. One was incubated with calcein without inhibitors. Second part was inhibited by 50μM verapamil, which inhibits both, Pgp and mrp1. The third part was inhibited by MK-571 molecule, which inhibit mrp1 only. The fourth part was inhibited by 10 μM verapamil, which inhibit mdr1 only. All inhibited cell solutions were then incubated with calcein. We analysed the intracellular fluorescence of the cells by FACS method. In order to express the fluorescent activity of the inhibited and non inhibited cells we calculated the MAF-(multidrug resistance activity factor-) values. These will characterize the Pgp and mrp1 function of the cells.