Endothelin kimutatása kutyavizeletből

Abstract

Az endothelinek (ET) 21 aminosavból álló vazoaktív peptidek, melyeknek emlősökben 3 fajtája (ET-1, ET-2, ET-3) ismert. Számos, az emberorvoslásból származó és kísérleti állatokon végzett vizsgálat eredménye alapján elmondható, hogy az ET sokrétű fiziológiás és kórélettani funkciója mellett, szerepet játszik egyes vesebetegségek kórfejlődésében is. Mivel az ET szekréciója főleg abluminalis és az ET felezési ideje mindössze néhány perc, a vérplazmában keringő ET koncentráció nem tükrözi megfelelően a vesében zajló változásokat. A vizeletből kimutatható ET azonban szinte 100%-ban a vese velőállományából származik. Kutyák mindhárom ET molekulájának 100%-ban megegyezik az aminosav sorrendje az emberi endothelinekével, így a humán ET kimutatására szolgáló eljárások (pl. ELISA) elméletileg jól alkalmazhatóak kutyákban is. Kutyák vizeletének ET tartalmát azonban még nem vizsgálták. Kutatásunk célja, hogy a kereskedelmi forgalomban kapható humán ET szendvics ELISAtesztek közül kettőnek, - Biomedica, Bécs, Ausztria, és Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd (IBL)- megvizsgáljuk az alkalmazhatóságát a kutyavizelet ET meghatározására. A vizeleteket vesebeteg kutyákból gyűjtöttük cystocentesissel, a laboratóriumi vizsgálatok során a gyártók útmutatását követtük. A validálás során az „intra-assay variabilitást”, a pontosságot és a hígítási linearitást vizsgáltuk. Az „intra assay variabilitást” 12 vizeletminta azonos teszten történő 7-10x-es ismételt lemérésével, majd a szórás és a variációs koefficiens kiszámításával ellenőriztük. A linearitás meghatározását úgy végeztük, hogy a vizeletmintához közepes, illetve magas koncentrációjú gyári standard oldatot adtunk, majd hígítás nélkül, valamint 2x-es, 4x-es és 8x-os hígítás után megmértük azok ET tartalmát. A hígítószer mindig azonos volt a kit saját referencia hígítási sorához használt anyaggal (desztillált víz vagy salsol). A mért és számított értékeket egymással összevetettük és regresszió-analízist, továbbá az átlagos eltérések és azok szórásának a kiszámítását elvégeztük. A Biomedica gyártó kittjeinek precizitása három vizeletminta esetében jónak (CV: 9-18%), két esetben közepesnek (CV: 20-28%) adódott, az IBL tesztje nem volt megítélhető, mivel a 7 vizeletmintából csak egynek tudtuk az ET-tartalmát lemérni. A hígítási sorok a Biomedica teszt esetén nem lineáris visszamérhetőségről (R2=0,88) tanúskodtak. Bár az IBL teszt hígítási sorainak R2 értéke 0,99 felett volt, a klinikailag lényeges tartományban a mért értékek -20,4 ± 16,4 %-al eltéréssel mérte le a teszt. Az eltéréseket feltehetően a vizeletben lévő anyagok mátrix hatása okozta. 21 A vizsgálataink eredménye alapján úgy tűnik, sem a Biomedica, sem az IBL ET-1 ELISA kitje nem alkalmas a tisztítatlan kutyavizelet ET-tartalmának meghatározására.

Endothelins (ET) are 21 amino acid vasoactive peptides, which have 3 forms in most mammals (ET-1, ET-2, ET-3). Besides their numerous physiologic roles, ET play a role in the pathogenesis of certain renal disorders. Since the secretion of ET are mostly abluminal, and the half-life of circulating ET is not more than a few minutes, plasma levels of ET don’t represent renal tissue levels. However, urinary ET originates 100% from the kidney medulla. All three forms of canine ET have 100% homology with human ET, thus human immune tests (ELISA) are theoretically also applicable to canine samples. There is no published report on the determination of urinary ET of the dog. The aim of our study was to assess the applicability of two human sandwich ELISA-tests - Biomedica, Wienna, Austria, and Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd (IBL) - on the determination of dogs’ urinary ET contents. Urine samples were collected via cystocentesis from canine kidney patients and the test were performed in accordance with the manufacturers’ instructions. Our validation included the determination of intra assay variability, accuracy and dilutional linearity. Intra-assay variability was determined by calculating the coefficients of variation (CV) for 7-10 replicates of 12 canine urine samples. Dilutional linearity was evaluated by measuring peptide concentrations in spiked urine samples containing moderate or high concentrations of peptides before and after dilution (1:2, 1:4 and 1:8). Dilution studies were performed using the same dilutents that were also used for the assay standards (distilled water, Salsol, assay buffer). The expected values were plotted against the observed values and the correlation coefficients, the mean differences and the standard deviation of the differences were calculated. The Biomedica Elisa kits performed well in precision studies in case of 3 urine samples (CV: 9-18%), and medium in case of two other ones (CV: 20-28%). We could not assessed the precision of the IBL test, as the test could measure the concentration of only one urine sample of the seven. Dilutional studies revealed non-linear recovery in case of the Biomedica test (R2=0,88). Even though the R2 value was above 0,99 when we assessed the recovery of serially diluted spiked urines with the IBL test, the mean difference between measured and the expected values was -20,4 ± 16,4 % in the clinically relevant range of concentrations. These alterations were probably due to the matrix effect of canine urine samples. Based on our results we recommend neither the IBL nor the Biomedica ELISA test for the determination of the ET content of non-purified canine urine samples.