Development of genomic and subgenomic Taqman real-time RT-PCR for detection and quantification of equine arteritis virus

Abstract

Serological investigations have displayed how widespread EAV is worldwide. Reliable, quick and accurate detection methods are critical not only for rapidly diagnosing acute outbreaks, but also preventing a further spread of EAV. The goal of this paper was to summarize the newly developed double QPCR method and accentuate its practical use. The research was done with 56 semen samples from asymptomatic Lipizzaner stallions and with 13 frozen semen samples of equine origin sent by the laboratory of the AFSSA. On the basis of TaqMan chemistry the g-QPCR and sg- QPCR assays were developed using M and N gene sequences to construct a common reverse primer and probe, while the EAV leader sequences were aligned to build the forward primer with different sense primers targeting the distal part of the leader sequence and the M gene. Time course virus propagation was performed in RK-13 and RNA extraction and reverse transcription were carried out. Using exactly the same clinical samples with the g-QPCR and sg-QPCR runs, 10 to 1000 times greater genomic viral copy numbers could be observed than subgenomic ones. There must be at least 100 genome equivalent copies and replicating viruses present in the samples for the sg-mRNA to be detected. From the data obtained, it may be presumed that the novel dual QPCR method is a valuable means for examining the viral load and the shedding state of the stallion.

Az EAV elterjedtségét szerológiai vizsgálatok adatai bizonyítják. A megbízható, gyors és pontos kimutatási módszerek döntő fontosságúak nemcsak a járványkitörések gyors kórjelzésében, hanem az EVA tovább terjedésének megakadályozása szempontjából is. Dolgozatom célja volt egy újonan kifejlesztett kettős QPCR tulajdonságainak bemutatása és a módszer gyakorlati felhasználásának kiemelése. A kutatást 56 tünetmentes Lipicai mén ondómintájának és a Ring teszt keretén belül 13 az AFFSA által küldött, fagyasztott ondóminta quantitatív vizsgálatával végeztük Munkacsoportunk TaqMan módszeren alapuló g-QPCR és sg-QPCR teszteket fejlesztett ki. Az M és N gén szekvenciákra tervezett közös reverz primer és próba DNS alkalmazása különböző forward primerekkel, melyek közül az egyik a leader szekvencia distális részére, a másik az M gén distális részére tapad, lehetővé vált egyazon minta genomikus és szubgenomikus RNS-einek párhuzamos, egyidejű vizsgálata. A kettős PCR víruskinetikai vizsgálatok elvégzésére is lehetőséget nyújtott RK sejttenyészeten szaporított EAV vírussal. Ugyanannak a klinikai mintának a szubgenomikus kópiaszám 10-1000-szeresét sikerült kimutatnunk Legalább 100 genomkópiát kell tartalmaznia egy mintának, hogy abból vírusreplikáció esetén szubgenomikus m-RNS-t is ki lehessen mutatni. A kapott eredményekből feltételezhető, hogy a kettős QPCR módszer értékes eszköz mind a minta vírus tartalmának, mind pedig egy mén vírusürítő státuszának meghatározására.