Adenovírusok kimutatása hüllőkben és kétéltűekben: két gyík- és egy béka-adenovírus genomjának részleges szekvencia analízise

Abstract

Az adenovírusok (Adenoviridae) a gerinceseket gyakran fertőző, dupla szálú DNS genommal rendelkező vírusok. Jelenlétüket mára az összes gerinces osztályban, így hüllőkben és kétéltűekben is kimutatták. Az egyes adenovírus típusok általában szűk gazdaspektrummal rendelkeznek, vagyis minden gazdafajnak lehet saját adenovírusa. Ez teszi e vírusokat alkalmassá koevolúciós vizsgálatokra. A kutatócsoport korábbi eredményei szerint a jelenleg elfogadott öt genus közül az Atadenovirus nemzetség képviseli az adenovírusok pikkelyes hüllőkkel (Squamata) együttfejlődött leszármazási vonalát, noha az első atadenovírusokat kérődzőkben és madarakban mutatták ki. Korábban egy kígyóból származó izolátumról a teljes genom analízise és filogenetikai számítások segítségével bizonyították, hogy atadenovírus. Ezen felül több gyík és kígyó mintájában PCR-rel detektált vírus vizsgálata is azt mutatta, hogy e genus tagjai. Kétéltűekből eddig egyetlenegy alkalommal mutattak ki adenovírust, mely a Siadenovirus genus tagja. Emiatt a kezdeti hipotézis szerint ez a vonal fejlődhetett együtt elsődlegesen kétéltűekkel. Célkitűzésem az volt, hogy újabb bizonyítékokat tárjak fel az atadenovírusok hüllő eredetével kapcsolatban, valamint több információt gyűjtsek a kétéltűeket fertőző adenovírusokról. A megvalósítás érdekében 187 hüllő- és 157 kétéltű-minta PCR-es szűrését végeztem el konszenzus nested primerekkel. Ezen kívül két Heloderma-faj, Németországban izolált adenovírusának genomjából nyertem ki további szekvenciákat. A mexikói viperagyíkból (Heloderma horridum) izolált adenovírus genomjának közel 75%-át sikerült meghatározni. A másik izolátum esetén is meghatároztuk a genom mintegy 40%-át. A genom-analízisek mindkét esetben egyértelműen bizonyították, hogy atadenovírusokról van szó. A szűrések során hüllők esetén 17, még a kétéltűekből összesen 4 minta bizonyult pozitívnak. Ezek újabb bizonyítékként szolgáltak a szakállas agámák (4 minta) és a Colubridae családba tartozó siklófajok (2 minta) nagymértékű fertőzöttségére, valamint két teljesen új vírust mutattunk ki 10 rövidfarkú törpekaméleon- és egy fehértorkú varánusz mintájából. A kétéltűek közül Dendrobates auratus és Phyllobates vittatus fajokban mutattam ki adenovírusokat, melyek mind aminosav, mind nukleotid szinten azonosnak bizonyultak. Ez szintén a tudomány számára új vírus, emellett mindössze a második kétéltűekben leírt adenovírus. A szekvenciájából kb. 8500 bázispár került leolvasásra, mely alapján kiderült, hogy – akárcsak a hüllőkben talált adenovírusok – az Atadenovirus genus tagja. Az atadenovírusok hüllő eredetére bizonyíték az új vírusok pozíciója a törzsfán, és a genomuk kiegyensúlyozott G+C tartalma. A nyílméreg-béka-adenovírus a törzsfarekonstrukción a kérődző-atadenovírusokkal került egy monofiletikus csoportba és a G+C arány mindössze 38,4%. Mindezek arra utalnak, hogy a kétéltűek atadenovírus-fertőzöttsége gazdaváltás eredményeként jöhetett létre.

Adenoviruses are double-stranded DNA viruses infecting vertebrate hosts, such as reptiles and amphibians. The different adenovirus types possess quite narrow host spectra, that are each animal species may have its own adenovirus, therefore these viruses are perfectly suitable for investigating co-evolution. According to previous results of the research group, Atadenovirus is supposed to be the genus co-evolved with Squamata from the five presently approved genera of Adenoviridae, though first members were found in ruminants and birds. Based on whole genome analysis and phylogenetic calculations, an isolate from a corn snake previously proved to belong to the atadenoviruses. Moreover, the analysis of several lizard and snake samples by PCR likewise pointed towards atadenoviruses. The only adenovirus ever detected in amphibians proved to be a siadenovirus, which genus was supposed to be the lineage co-evolved with amphibians. The aim of my study was to uncover further evidence concerning the reptilian origin of atadenoviruses. I also analysed amphibian samples because of the lack of information on amphibian adenoviruses. Altogether 187 reptile and 157 amphibian samples were screened by nested PCR, which amplifies a 300 bp long fragment of the viral DNA polymerase gene. Further sequences were sequenced from the genomes of two Heloderma adenoviruses previously isolated in Germany. About 75% was sequenced of the genom of the Mexican beaded lizard (Heloderma horridum) adenovirus while further 40% of the Gila monster (Heloderma suspectum) adenovirus. Both viruses were clearly evident to be atadenoviruses. Among the reptile samples 17, while only 4 amphibian samples proved to be positive in the PCR screening. Further evidences were uncovered of the high infection rate in bearded dragons (4 samples) and in colubrid snakes (2 samples). Two novel adenoviruses were revealed from the samples of one white-throated monitor (Varanus albigularis) and 10 short-tailed pygmy chameleons (Rampholeon brevicaudatus). Two identical viruses were detected in 4 amphibian samples (2 Dendrobates auratus, 2 Phyllobates vittatus) at both amino acid and nucleotide levels. The virus is not only supposed to be a novel one, but the 2nd amphibian adenovirus ever described. About 8500 bp of its genom was sequenced fortifying it can be assign – similarly to the reptile viruses investigated – to the genus Atadenovirus. Both the position of all the detected and sequenced reptile adenoviruses and the balanced G+C content of their genomes verify the reptilian origin of atadenoviruses. The adenovirus revealed from the poison-dart frogs clusters together with the ruminant atadenoviruses at the phylogenetic tree while having an extremely low G+C ratio of 38.4%. According to this facts, the atadenovirus infection in amphibians supposed to be the result of a host switch.