Különféle vizi állatok szűrése PCR-rel adenovírusok és herpeszvírusok kimutatása céljából

Abstract

Szakdolgozati munkám témája halak és más vízi állatok (kagylók, bolharákok) PCR-rel történő szűrése volt adenovírusok (AdV) és herpeszvírusok (HV) kimutatása céljából. A hazai halpopulációk, illetve a vizekben a kórokozókat passzívan akkumuláló szervezetek fertőzöttségének mértékét kívántuk felmérni, de új AdV-ok és HV-ok felismerésére is számítottunk. Időközben a laboratóriumunkban (és ezzel egy időben az Egyesült Államokban) az eddig ismertektől jelentősen eltérő leszármazási vonalhoz tartozó AdV-okat mutattak ki ékszerteknősökben. Ennek az új AdV-nak ismételt megtalálása céljából a későbbiekben teknősökre is kiterjesztettem vizsgálataimat. A minták egy része a laboratórium korábbi gyűjtéseiből származott. A gerinctelenek és teknősök mintáit, és a halminták nagyobb részét én szereztem be. Mindkét víruscsalád tagjainak kimutatására olyan PCR-t használtam, amelynek során a vírusok DNS-függő DNS polimeráz génjének egy szakaszát lehet felsokszorozni. HV-ra a 333 vizsgált minta mindegyikét negatívnak találtam. Az AdV-ra vizsgált 570 minta közül is csak az ékszerteknősök között volt pozitív. A véletlenszerűen gyűjtött, 44 mintából 12 (27%) bizonyult pozitívnak. A szekvenálás és filogenetikai elemzés alapján megállapítottam, hogy az újnak látszó AdV a hazai (budapesti) ékszerteknős populációban viszonylag gyakran előfordul. Az új AdV változatait 5 sárgafülű és 7 vörösfülű ékszerteknős mintájában találtam meg. A PCR termékek szekvenálása 8 tiszta és 4 kevert szekvenciát eredményezett. A további AdV gének kimutatására tervezett PCR-ek közül csupán egy működött, amellyel a hexon génből nyertünk ki rövid szakaszt 2 mintából. A DNS polimeráz származtatott aminosav szekvenciája 5 különböző, gazdafüggetlen variáns meglétét mutatta, míg a hexon részleges szekvenciája az egyes mintákban azonos volt. A fertőzött állatok 2 hulla kivételével egészséges, jó kondícióban lévő egyedek voltak, így a vírus esetleges kórokozó képessége nem tisztázott. A két génszakasszal végzett törzsfa-rekonstrukciók megerősítették, hogy az új AdV-ok az Adenoviridae családon belül önálló csoportot képeznek, és nemzetség szintű elkülönítésük is indokolt lehet. Ehhez további vizsgálatok szükségesek. Az új AdV leszármazási vonal valószínűleg megfelel a teknősökkel együtt fejlődött AdV csoportnak, amit az is alátámaszt, hogy DNS-ük G+C tartalmát kiegyensúlyozottnak (50% körülinek) találtam.

The topic of my diploma work was the screening of fishes and some other aquatic animals for the presence of adenoviruses (AdV) and herpesviruses (HV) by PCR. Our aim was to assess the prevalence of these viruses in the domestic fish populations and in some other organisms that can accumulate the viruses passively. The recognition of several new AdVs and HVs was also expected. During the time of my PCR survey, a new AdV was discovered in a yellow-bellied (YB) slider (Trachemys scripta scripta) in our laboratory, and almost simultaneously in a red-eared (RE) slider (T. s. elegans) in the USA. The preliminary phylogenetic analysis implied that the new slider AdVs represent a new lineage that is significantly different from the approved AdV genera known to date. To find this novel AdV again, I have expanded the collection of samples to Hungarian slider colonies. Part of the samples was from the collection of the laboratory, whereas the majority of them including every slider and invertebrate (mussels, amphipods) sample were acquired by me. For the detection of members of each virus families, a PCR with primers targeting the gene of the respective DNA-dependent DNA polymerase was used. After having screened 570 (367 fish, 156 invertebrates and 47 turtles) samples, only slider turtles were found to be positive for AdV. From the randomly collected 44 samples 12 (27%) were positive with sequencing and phylogenetic calculations. None of the 333 samples were positive for HVs. Slightly divergent AdV sequences were detected in 5 YB and 7 RE sliders. From two samples, a small fragment of the hexon gene was also amplified successfully. The sequence of the PCR products was clean in 8 cases (representing 5 variants), while the other 4 samples seemed to contain more than one type of AdVs. The positive animals with two exceptions were healthy-looking live adults, thus the pathogenic role of the new AdV remains unclear. Phylogeny reconstructions with either partial gene sequence, confirmed the separation of a monophyletic clade within the family Adenoviridae. The new AdV lineage will probably merit the rank of a new genus, but further data are needed. The balanced base composition (with a G+C content of around 50%) suggest that this new AdV lineage has co-evolved most likely with the testudinoid turtles.