Az elmúlt 30 évben Magyarországon izolált EHV-1 vírustörzsek genetikai tulajdonságainak vizsgálata

Abstract

Vizsgálataink célja 35, 1977 és 2008 között, vetélt lómagzatokból származó ló herpesvírus-1 (EHV-1) izolátum, továbbá két referencia törzs (ARMY-183, RacH) genetikai vizsgálata volt. Elsősorban a patogenitást meghatározó markereket kerestünk, illetve olyan szakaszok vizsgálatát szerettük volna elvégezni, amelyek alapján az izolátumok eredetét és genetikai alapú rokonságát meghatározhatjuk. Az összehasonlításhoz a genom két régiójának szekvenciáit elemeztük (az ORF68 és az ORF30 szakaszt), ugyanis irodalmi adatok alapján ez a két nyitott leolvasási keret (open reading frame, ORF) bizonyult a legalkalmasabbnak a kitűzött céljaink megvalósítására. Az ORF30 régió 2254-es nukleotid pozíciójában előforduló pontmutáció meghatározhatja azt, hogy az adott EHV-1 törzs mekkora eséllyel képes idegrendszeri tüneteket kiváltani a gazdaállatban egy fertőzés során. Az ORF68 szekvenciája nem befolyásolja ugyan nagymértékben a vírustörzsek patogenitását, azonban egy kb. 600 bázispár hosszúságú polimorf szakasz vizsgálatával, az ott előforduló pontmutációk alapján az izolátumokat különböző csoportokba lehetett rendezni. A kialakított csoportok tagjainak földrajzi előfordulásában már előzőleg is találtak szabályszerűségeket, a mi vizsgálati eredményeink ezeket meg tudták erősíteni. A szekvencia különbségek meghatározására mindkét régió esetében saját módszereket használtunk. Az ORF30-ban előforduló SNP (single nucleotide polymorphism, egyedi nukleotid polimorfizmus) kimutatására egy olyan speciális eljárást alkalmaztunk, amit eddig főleg hólyagos betegségeket okozó vírusok (például ragadós száj - és körömfájásának vírusa (RSZKFV), sertések hólyagos betegségének vírusa (SVDV), illetve a sertések reprodukciós és légzőszervi tünetegyüttesének vírusa (PRRSV) különböző genotípusainak meghatározására használtak. Az általunk kifejlesztett módszer is az ezeknél felhasznált primer-probe energy transfer (PriProET) elvén alapul, ami gyors és biztos módszernek bizonyult a neuropatogén és nem neuropatogén genotípusba tartozó EHV-1 törzsek elkülönítésére. A módszer segítségével a Magyarországról származó 35 izolátum közül öt (14%) olyat találtunk, ami a 2254-es nukleotid pozícióban guanin (G) bázist kódolt, vagyis egy kialakuló fertőzés során nagy valószínűséggel idegrendszeri tüneteket képes kiváltani. A RacH vakcinatörzs egyedi szekvenciát kódol a vizsgált ORF30 szakaszon. Ez a különbség a vizsgálataink eredményeiben úgy jelentkezett, hogy a RacH törzshöz tartozó olvadáspont görbe a neuropatogén és nem neuropatogén típusba tartozó törzsektől eltérő pozícióban, a két genotípushoz tartozó görbék között jelent meg. Az ORF68 szakasz polimorf régiójának genetikai elemzéséhez saját primereket terveztünk, ugyanis az eredeti cikkben szereplő primerekkel nem kaptunk megbízható eredményeket. A DNS templátok amplifikációja után a polimeráz láncreakció termékét minden izolátum esetén kétszer szekvenáltuk, majd az esetlegesen előforduló pontmutációk alapján csoportosítottuk a Magyarországon izolált, illetve a referencia törzseinket. Egy előző tanulmányban megvizsgált 108 EHV-1 törzs ORF68 szekvenciáinak eltérései alapján összesen hat csoportot alakítottak ki. Ebbe a hat csoportba a 35 magyar izolátum közül 23-at tudtunk besorolni, ami a törzsek 66%-át jelentette. A többi törzs ORF68-as régiójának polimorf szakaszán olyan pontmutációk fordultak elő, amelyeket eddig még nem írtak le, ezekből a törzsekből négy újabb csoportot alakítottunk ki. Az angol kutatók eredményeitől eltérően, a legtöbb magyar izolátum abba a csoport került (2-es csoport), amelyik az eredeti tanulmány szerint főleg észak-amerikai törzseket tartalmazott. Ezzel ellentétben a 3-as csoportba, melyhez az eredeti vizsgálat szerint az európai törzsek nagy része tartozott, a magyarországi törzseknek csak kevesebb, mint ötödét (17%) tudtuk besorolni. A csoportok nagy részének elterjedése időben és térben is elkülönült a többi csoportétól, ezzel igazoltuk azt a feltevést, hogy az eltérő pontmutációkat tartalmazó törzsek előfordulása bizonyos szabályszerűségeket mutat. Az általunk kidolgozott módszer tehát megkönnyítheti egy adott régióban előforduló EHV-1 vírusok nyomon követését, továbbá ezzel együtt segítséget nyújthat a járványtani nyomozás során. Ahhoz azonban, hogy minél részletesebb és pontosabb adatok álljanak rendelkezésre, a hazánkban előforduló további EHV-1 törzsek genetikai elemzésére van szükség.

The present studies was aimed at grouping of 35 Hungarian equine herpesvirus-1 (EHV-1) isolates by the single nucleotide polymorphisms (SNP) of two open reading frames (ORFs) in the virus genome, ORF68 and ORF30, respectively. In a former study, two EHV -1 strains (Ab4, V592) were compared, and the results showed that these two regions are suitable for the distinction of EHV-1 strains. The substitution in the 2254 nucleotide position of ORF30 region can influence the neuropathogenic potential of the virus strain. In contrast, while the SNPs in ORF68 cannot be connected to pathogenicity, these substitutions allow classification of EHV-1 strains in different groups. The occurrence of members of distinct groups in different outbreaks can facilitate epidemiological investigations, because the geographical distribution of a particular group is very often specific. All the Hungarian EHV-1 isolates were originated from aborted horse foetuses isolated between 1977 and 2008. Two laboratory EHV-1 strains (ARMY 183, RacH) were also included in the genetical examinations of EHV-1 strains beside the Hungarian isolates. For the characterisation of both specific genetic regions we used newly developed methods. A former comparison of neuropathogenic and non-neuropathogenic EHV-1 strains revealed that a single amino acid coding nucleotide substitution (A/G2254) in the ORF30 region is associated with the altered functions of the viral DNA polymerase, and consequently the neuropathogenicity of EHV-1 virus strains. For the detection of this substitution we developed a new real-time PCR assay, based on primer-probe energy transfer (PriProET). Our results verified the presence of neuropathogenic EHV-1 strains in Hungary, five of 35 isolates (14%) were the members of the G2254 (neuropathogenic) genotype group. The results of melting temperature analysis showed exact correlation with the sequence variations of the targeted region of ORF30, and the two genotypes (A/G2254) could be easily identified by the different peaks of melting temperatures. The RacH strain has a unique sequence in the targeted region, therefore this strain cannot be assigned to any of the two groups set up previously, and its melting temperature analysis curve was found between the curves of the two genotypes. The only isolate (04_04), which could be connected to neurological symptoms in the infected horses, also encoded G at the 2254 nucleotide position. After sequencing the particularly polymorphic region of ORF68, the Hungarian EHV-1 isolates could be classified into seven groups. Only 23 of the 35 (66%) isolates belonged to the formerly described groups, while the SNPs of 12 isolates diverged, and four new groups could be set up. In previous studies groups 2 and 5 contained mostly North American strains, while in group 3 predominantly European isolates were found. In contrast, the 40% of Hungarian isolates (14/35) belonged to group 2 but group 3 included only four EHV-1 strains (11.4%). The variation of ORF68 in some certain groups can be associated with the geographical distribution of strains, but the analysis of these genetic markers primarily provide information about the circulation of EHV-1 strains in a designated area, which can help the epidemiological investigation after an EHV-1 outbreak.