A baromfi Salmonella Enteritidis elleni korai védelmet szolgáló törzsek előállítása virulencia plazmidre és flagellin rendszerre irányuló mutagenezissel

Abstract

Munkánk elsődleges célja olyan transzpozon mutagenezis rendszerek kidolgozása és kipróbálása volt, melyek segítségével Salmonella Enteritidis törzsek markerezése és virulencia csökkentése érhető el, távlati vakcina fejlesztések céljából. Részletesebben: 1. A Salmonella Enteritidis és néhány egyéb érdekes szerovariáns törzseinek PCR-es vizsgálata flagellin termelés és flagellin fázisváltás szempontjából. 2. Salmonella flagellin génekre kidolgozott irányított transzpozon-mutagenezis rendszer létrehozása és működésének vizsgálata annak érdekében, hogy flagella mentes, ezáltal markerezett vakcinajelölt törzset állítsunk elő. 3. A markerezett törzs virulenciájának csökkentése a virulencia plazmid kiűzésével. 4. Az így előállított Salmonella Enteritidis vakcina jelölt törzsek korai védőhatásának vizsgálata. Munkánk első lépésében egy PCR-es tesztelő rendszert terveztünk, amely alkalmasnak bizonyult Salmonella törzsek flagellin termelő génjeinek és a flagellin fázisváltó rendszer elemeinek vizsgálatára. E módszerrel megerősítettük, hogy a Salmonella Enteritidis törzsek flagellin fázisváltásra való képtelenségének oka, hogy azokból mindig hiányzik a salmonellákra jellemző fázisváló rendszer és csak a fliC gén, valamint annak operátor szekvenciája van jelen. Annak érdekében, hogy a vakcina jelölt törzseinket molekuláris markerrel lássuk el, irányított transzpozon-mutagenezis rendszert dolgoztunk ki a Salmonella flagellin génekre. Ennek során a flagellin represszor fljA gént fúzionáltattuk az IS30 transzpozáz génjével, majd az így létrejött IS30-FljA fúziós fehérje működését a Salmonella Enteritidis 11 jelű törzsünkben vizsgáltuk. A módszer segítségével több flagellin bénított mutánst állítottunk elő. A hagyományos módszerekkel nehezen kiűzhető, nagyméretű Salmonella virulencia plazmid kiűzésére új, transzpozon alapú eljárást dolgoztunk ki. A módszer a flagellin mentes S. Enteritidisben nagy (50% feletti) virulencia plazmid űzési gyakorisággal működött. Az előállított nem mozgó (SE2102) valamint „virulencia plazmid mentes, nem mozgó” (SEΔ155) Salmonella Enteritidis 11 származékok virulencia tulajdonságait in vitro (sejtkultúrán), és in vivo körülmények között (naposcsibe modellen) vizsgáltuk. A szülő törzshöz képest mind a SE2102, mind a SEΔ155 mutáns in vitro sejt inváziós képessége igen jelentősen csökkent. Szintén csökkent in vivo körülmények között a mutánsok naposcsibe szerv inváziós képessége, míg a vakbélben elért élő csíraszámok nem változtak jelentősen. A SE11 törzs egyik, virulencia plazmid mentes, nem mozgó mutánsának korai védekező képességet stimuláló hatását vizsgálva megállapítottuk, hogy egyszeri alkalmazással a ráfertőző vad virulens törzs szerv inváziójával szemben a szülő törzshöz hasonló mértékű, jelentős, az élet első négy hetében jól érvényesülő korai védelmet nyújtott.