Genetikai módszerek a vakcina-ellenőrzésben

Abstract

Az állatgyógyászati vakcinák ártalmatlanságának, tisztaságának és idegen ágens mentességének biztosítása kiemelkedő fontosságú feladat. Az oltóanyag engedélyezési eljárása során a gyártó által előállított terméket az engedélyező állami hatóság aprólékos vizsgálatoknak veti alá, amelyek célja a termék ártalmatlanságának, tisztaságának, hatékonyságának és hatásértékének megállapítása. Az oltóanyagnak, mint biológiai hatással bíró produktumnak különlegesen szigorú feltételrendszernek kell megfelelnie, amely garantálja, hogy felhasználása során az elvárt hatást fejtse ki. Munkám során azokat a hatósági vakcinaellenőrzésben felmerülő speciális kérdéseket, problémákat próbáltam megoldani a molekuláris biológia módszereivel, amelyeket a hagyományos vizsgálati módszerekkel egyáltalán nem lehet megoldani, vagy csak állatkísérletekkel, valamint idő- és munkaigényes eljárások alkalmazásával. E célból élő vírus tartalmú vakcinákat vizsgáltam, illetve ezen vakcinák felhasználása során felmerülő problémák ¬– pl. revertálódás, hatáselmaradás, szennyezettség – megoldására tettem kísérletet a molekuláris biológia eszközeivel. Elsőként RT-PCR és RFLP segítségével 12, az ÁOGYTI-ba engedélyezésre beküldött NDV vakcinával végeztem kísérleteket. Az RT-PCR közvetlenül az ampullából tisztított RNS-ből történt, a vakcinavírus előzetes, tojásban történő elszaporítása nélkül. Az M gént amplifikáltuk, majd HinfI és MboI RE-vel emésztettük. A kapott RFLP szerint az egyik gyártó LaSota tartalmú vakcinája egy másik vakcinatörzzsel, B-1-gyel volt szennyezett. Egy másik gyártó esetében a törzskönyvi dokumentáció szerinti VG/GA törzs helyett V4 Queensland törzset találtunk az ampullában. A B-1 szennyezettség gyári eredetének bizonyítására plakktisztítást végeztünk, amellyel sikerült a LaSota és B-1 komponenseket szétválasztani. Munkám második felében svédországi IBV járványesetekből származó mintákat vizsgáltunk. E célból egy diagnosztikai és egy filogenetikai RT-PCR rendszert dolgoztunk ki az N és az S1 génekre. A PCR termékek nukleotidszekvenciáját meghatároztuk és filogenetikai analízisnek vetettük alá. E szerint kétféle vírustörzs került be Svédországba, D274 szerotípusú és Massachusetts szerotípusba tartozó. Tekintve, hogy Svédország 1997 előtt az IBV szempontjából ún. „nem vakcinázó” ország volt, különösen érdekes, hogy az 1997 utáni mintákból származó Massachusetts szerotípusú vírusok az S1 génen 100%-os homológiát mutattak a Ma5 vakcinatörzzsel. Ezzel szemben az 1997 előtti mintákból származó vírusok, ugyanezzel a vakcinatörzzsel a vizsgált génen csak 86-94%-ban egyeztek meg. Mindebből valószínűsíthető, hogy a járványesetek egy részéért vakcinavírusok voltak felelősek. A D274 vírus eredetét nem sikerült tisztázni. Munkám harmadik fejezetében az atípusos myxomatózis első közép-európai megjelenéséről, illetve a kór virológiai vizsgálatáról számolok be. Shope fibróma vírus tartalmú oltóanyaggal vakcinázott telepen 2001. februárjában aspecifikus myxomatózis kórforma ütötte fel a fejét. A természetes elhullásból származó szemhéj, tüdő, tejmirigy és végbél minták PCR és elektronmikroszkópos vizsgálatával sikerült a myxoma vírust kimutatni, amelyet BP04/2001 jelzéssel láttunk el. A BP04/2001 jelzésű izolátummal elvégzett klinikai és virológiai vizsgálatok igazolták, hogy a magyarországi megbetegedések hátterében az eddig csak Franciaországban és Belgiumban előfordult atípusos myxomatosis kórokozója áll.

Ensuring the efficacy, potency and safety of the veterinary vaccines is a highlighted issue. However, the vaccines are subjected by manufacturers to very scrupulous examinations in order to obtain data about the main parameters mentioned above and to warrantee the appropriate quality and effect of the vaccines, there are several reports about serious adverse effects, reduced protective effect of vaccines. Used molecular methods I tried to work out the most charatceristic problems of the official vaccine control, which either cannot be solved by traditional virological methods or only by applying time consuming procedures. For this purpose I examined vaccines containing live virus and problems caused by these vaccines. First, 12 NDV vaccines sent for registration procedure were analysed. The RT-PCR was carried out, using the RNA purified directly from vials without any egg inoculation. The matrix (M) gene of NDV genome was amplified and digested by HinfI and MboI. According to the RFLP a homologue contamination was revealed, i.e. the LaSota vaccine strains was contaminated with B-1 strain. The two components were separated by plaque purification obtaining unequivocal prove of a contamination which may have happened during the manufacturing procedure. In case of another NDV vaccine, the vial should have contained VG/GA vaccine strain according to the dossier but V4 Queensland strain was found. In the second chapter, samples from outbreaks in Sweden were examined by RT-PCR. A „diagnostic” and a „phylogenic” RT-PCR were carried out. The amplicons were analysed by MegAlign software. D274 and Massachusetts strains were identified. Considering the fact, that before 1997 Sweden was a „non-vaccinating” country, it is very interesting that the Massachusetts strains after 1997 showed 100% similarity with the vaccine strain Ma5 used in Sweden. In contrary of the samples after 1997, the Massachusetts strains before 1997 showed only 86-94% similarity with the vaccine strain mentioned above. The studies revealed a strong possibility that the vaccination had lead to the spread of the vaccine virus, causing various disease manifestation and confusing epizootiological situation in the poultry population. In the third chapter, the first appearance of the atypical myxomatosis in Central.Europe is reported. The virus was isolated from eyelid specimen of a naturally infected rabbit. Genetic analysis of the isolated virus was carried out by polymerase chain reaction (PCR) and direct sequencing. The primers were designed on the basis of the major envelope gene (Env) of the Lausanne reference strain in the GenBank. The viral proteins were examined by SDS-PAGE. The isolated virus (ref. No.: BP04/2001) was able to infect the susceptible animals directly, by contact way. The disease was characterised by respiratory symptoms of the upper tracheal tract, conjunctivitis and high mortality by the 11-14. day. The clinical and genetic examinations revealed that the cause of the disease is the atypical myxomatosis occurred in France and Belgium to date.