A vírusos lóarteritis hazai elterjedségének és a vírus genetikai állományának vizsgálata

Abstract

A vírusos lóarteritis magyarországi előfordulására irányuló vizsgálatok első szakaszában szerológiai módszerek segítségével sikerült a hazánkban található lóállományok nagy részének EVA fertőzöttségét leíró adatbázist felállítani. A különböző években gyűjtött vérminták vizsgálata alapján egyrészt megállapítható, hogy a fertőzés terjed Magyarországon, másrészt azonosítani lehetett a potenciálisan vírusürítő méneket. Ezen állatokból gyűjtött ondómintákat használtam a direkt víruskimutatási próbák (vírusizolálás és RT-PCR) során. A nukleinsav kimutatási eljárást nem csak a diagnosztikában, hanem a vírus genetikai összehasonlító vizsgálatai során is felhasználtam. Elsőként izoláltam a vírust Magyarországon, és a későbbiekben bebizonyítottam, hogy az eddigi nemzetközi publikációknak megfelelően, alkalmas mintakezelési technikával, megfelelően orientált mintavételezés mellett, viszonylag rövid idő alatt is nagyszámú vírus izolálható, és így ez a módszer önmagában is alkalmas a mének vírusürítő státuszának elbírálására. Megállapítottam, hogy a szeropozitív mének között hazánkban alacsonyabb (kb. 10%) a vírusürítő állatok aránya, mint a nemzetközi szakirodalomban szereplő értékek (kb. 30%). Nagyszámú mintán, rendszeresen alkalmaztam az általam kifejlesztett RT-PCR eljárást, és rutindiagnosztikai felhasználhatóságát összehasonlítottam a vírusizolálással. Az eredmények alapján megállapítható, hogy nem friss minták és magzatok esetében az izolálás megbízhatósága elmarad a nukleinsav-kimutatására alapozott eljárásétól. Fontos diagnosztikai megállapítása munkámnak a lovakban előforduló, vírus okozta vetélések arányának tisztázása. Bebizonyosodott, hogy a lovak herpeszvírusos vetélése, azonos időtartam alatt 8-szor gyakrabban fordult elő hazánkban, mint az EVA által okozott abortusz. Ugyancsak diagnosztikai célból a vírus nukleokapszid fehérje ellen termelt monoklonális ea-t (McAb) állítottunk elő, mely nagy hígításban is felismerte az EAV N fehérjét, és lehetőséget nyújtott a hazai vírusizolátumaink egy részének összehasonlító fehérjevizsgálatára is. A Mab az immunperoxidáz reakcióval (PLA) megfestett, valamennyi hazai genocsoportból kiválasztott, magyarországi EAV törzsekkel (41-ből 18) fertőzött sejttenyészetek mindegyikével és a referens Bucyrus törzzsel is pozitív reakciót adott, tehát a Mab konzervatív epitopot ismer fel az N fehérje felszínén, ezért az eddigi törzsekkel általánosan reagáló McAb-ot állítottunk elő. A teszt alkalmazása során lettünk figyelmesek arra, a 2000-ben még mások által nem alátámasztott megfigyelésre, hogy az EA vírussal fertőzött sejtek magjai viszonylag nagy mennyiségben tartalmaznak N fehérjét. Az izolált EAV törzsek szekvencia meghatározása, és későbbi összehasonlító vizsgálatai céljából szükségesnek mutatkozott egy másik, ezúttal a hipervariábilis régióra a GP5 fehérjét kódoló ORF 5 genomszakaszra tervezett RT-PCR létrehozása. Ez a régió nyújtott alapot más szerzők vírusgenetikai vizsgálatához is, így az évek során a génbankban számos, erről a területről nyert szekvencia vált hozzáférhetővé. Az egylépéses RT-PCR módszer alkalmazásával csökkentettem a keresztkontamináció lehetőségét és tovább javítottam a reakció specifikusságát. A járványtani nyomozás céljait szolgáló genetikai összehasonlító vizsgálataim során 20 hazai EAV törzs részleges nukleotid sorrendjét határoztam meg és filogenetikai analízis segítségével feltártam azok rokonsági viszonyait és lehetséges eredetét. Megállapítottam, hogy a 2000 előtt Magyarországon izolált EAV törzsek többsége egy korábban le nem írt, önálló alcsoportot képez (II.D), amelynek képviselőit 2000 után a világszerte előforduló, ismert genocsoportokhoz tartozó, különböző eredetű törzsek váltottak fel hazánkban. Vizsgálati eredményeim értékelésével felhívtam a szakemberek figyelmét a külföldről hazánkba hozott lovak (főleg a perzisztensen vírusürítő mének) és az EAV-fertőzött mélyfagyasztott ondóminták jelentőségére az EVA terjesztésében.

In the first period of the investigations aimed to determine the occurrence of equine viral arteritis (EVA) a database containing the infection rate of the majority of the great studs of Hungary was established. The investigation of the serum samples collected in different years proved that the infection is spreading, and also they helped to identify the potential virus carrier stallions. The semen samples collected from these animals were used in the direct virus detecting tests: virus isolation and polymerase chain reaction following reverse transcription (RT-PCR). The tests based on the amplification of the nucleic acid were used not only in the diagnostic work but also in genetic investigations. Within the framework of my PhD studies I have isolated the equine arteritis virus (EAV) for the first time in Hungary. Later I proved that applying a suitable preparatory technique and a well oriented sample collecting method several strains can be isolated within a relatively short period of time, as it is published in the relevant scientific papers, so this method is suitable to detect the virus shedder stallions. I have demonstrated that the seropositivity rate in Hungary is lower (about 10%) than the values published elsewhere (about 30%). I have developed an RT-PCR method and used it on a large number of samples, and compared its applicability in the routine diagnostics to virus isolation. The results have shown that in the case of not fresh and foetal samples the isolation is less reliable then the method based on the demonstration of the nucleic acid. These methods helped to determine the ratio of the different viral agents in the background of abortions, which was also an important part of my work. I have proved that the herpesviral abortion is about eight times more frequent in our country then the abortions caused by EVA. The production of monoclonal antibodies (McAbs) against the nucleocapsid (N) protein served also diagnostic purposes. The produced two McAbs recognised the N protein in high dilutions and helped the comparative studies of the protein structure of some of our virus strains. In a peroxidase linked assay (PLA) carried out on virus infected tissue cultures the McAbs recognised all Hungarian strains (18 from 41 isolate) belonging to different genetic subgroups and also with the referent Bucyrus strain, so it was concluded that the McAbs recognise a conservative epitop on the surface of the N protein, hence they react universally with the strains isolated so far. During the application of the test we detected that the nuclei of the EAV infected cells contain a relatively large amount of N protein, which phenomenon was not described at the time of these investigations (in 2000). The planned genetic comparisons, sequencing and the alignment of the sequences motivated the development of an other RT-PCR method amplifying a hypervariable genomic region (ORF5) coding the GP5 protein. The previous genetic studies were also based on this part of the genome; therefore several sequences were deposited in the international database (GeneBank). The developed one step RT-PCR helped to decrease the risk of cross contamination and enhanced the specificity of the test further. The partial nucleic acid sequences of 20 Hungarian EAV strains were determined in the genetic investigations serving the purposes of epizootiological investigations, and the phylogenic analysis revealed their similarities and possible origin. I have demonstrated, that the strains isolated in Hungary before 2000 form a new, previously not described subgroup (II.D), and that the representatives of this subgroup were replaced by virus strains of different origin and belonging to previously known strains distributed worldwide. By the conclusions of the results of my studies I helped to call the attention of the experts working on the field of veterinary administration to the role played by the horses (most of all the persistently infected stallions) and by the EAV contaminated deep frozen semen samples imported to Hungary from other countries in the spreading of EVA.