Az egér mesenchymalis őssejtek immunszupresszív aktivitásának vizsgálata

Abstract

Napjainkban számos munkacsoport foglalkozik a csontvelői mesenchymalis ős-vagy stromasejtek (BM-MSC) terápiás célú felhasználásával a hematopoézis támogatásában, a szövetek fenntartásában és regenerálásában, valamint a gyulladásos és immunfolyamatok gátlásában betöltött szerepüknek köszönhetően. Az MSC -k segítségével remélhetőleg kezelhetők lesznek olyan gyulladásos -és/vagy autoimmun betegségek, mint például az akut graft versus host-vagy a Chron-betegség. Rendkívül keveset tudunk azonban az MSC-k makrofágokra (Mf) gyakorolt hatásáról, így jelen munkánk célja annak vizsgálata volt, hogy milyen funkcionális következményei lehetnek e két sejttípus kölcsönhatásának, különös tekintettel a Mf -ok fagocitózis képességének és citokin termelésének esetleges változására. Mivel a csontvelő mellett egy számos szempontból ideálisabb sejtforrásból, a zsírszövetből is nyerhetők olyan MSC -k, melyek a BM-MSC-khez nagyban hasonló immunmoduláló funkcióval rendelkeznek, vizsgálatainkban ezért zsírszövetből izolált MSC-kre (AD-MSC) is kiterjesztettük. Kísérleteink során 10-12 hetes egerek csontvelőjéből, ill. zsírszövetéből származó MSC-ket és az állatok peritoneális üregéből kimosott Mf -okat használtunk. Vizsgáltuk az önmagukban, illetve MSC-k egyidejű jelenlétében szélesztett és 48 óráig inkubált Mf -ok élesztő-, valamint apoptotikus sejt (szteroiddal kezelt thymocyta) fagocitózisát, illetve antigén-bemutató képességüket. Meghatároztuk a tenyészetek felülúszóban található TNF (egy gyulladásos citokin), IL-10 (egy gyulladásgátló citokin) és PGE2 mennyiségét. Ugyanezeket a vizsgálatokat bakteriális endotoxinnal (LPS), illetve más TLR-ligandokkal (2-es, 3-as típusú) stimulált Mf -okkal is megismételtük. Megállapítottuk, hogy mind a BM-MSC-k, mind az AD-MSC-k képesek fokozni a Mf-ok fagocitáló képességét és egyidejűleg jelentősen megváltoztatják a szekretált citokinek arányát a kultúra-felülúszókban. Az MSC-k ugyanakkor képesek a Mf-ok antigén-bemutató képességét is fokozni. A TNF abszolút mennyiségét általában nem befolyásolják, a gyulladásgátló IL -10 termelését viszont jelentősen fokozzák,ennek a hatásnak az eléréséhez nincs szükség direkt sejt-sejt kontaktusra Mf -ok és MSC-k között. Ezek alapján az MSC-k jelenlétében a Mf-ok inkább gyulladásgátló (M2-es, vagy alternatív), mint „klasszikus” gyulladáskeltő (M1)-es fenotípust mutatnak. Az LPS-el in vitro aktivált Mf -ok M1 irányú polarizációját szintén gátolják a stroma sejtek. Ez a hatás indometacin, egy prosztaglandin szintézis gátló jelenlétében enyhén csökken, ráadásul a kultúra -felülúszók PGE2 koncentrációja az IL-10 mennyiségének növekedésével többé-kevésbé párhuzamosan nő, ami arra utal, hogy a PGE2 az MSC-Mf kölcsönhatás egyik fontos mediátora lehet. Olyan vizsgálati elrendezésekben, ahol Mf -ok, MSC-k és in vivo előaktivált T-sejtek vannak jelen, az MSC-k növelik a regulátor T-sejtek, valamint csökkentik a gyulladásos folyamatokban aktiváló szerepet játszó Th17 sejtek arányát. Eredményeink tehát azt mutatják, hogy az MSC-k szöveti eredetüktől (csontvelő ill. zsírszövet) függetlenül elősegítik a Mf -ok alternatív (M2), illetve gátolják „kl asszikus” – azaz gyulladás keltő –(M1) irányú polarizációját. Ennek meghatározó szerepe lehet az MSC-k in vivo megfigyelt erőteljes gyulladásgátló aktivitásában.

Recently, bone-marrow derived mesenchymal stem-or stromal cells (BM-MSC) have been subjects to several researches due to their ability to support hematopoiesis, promote tissue maintenance and regeneration and inhibit inflammatory and immune processes. MSCs are promising targets in the treatment of certain inflammatory and/or autoimmune diseases, such as acute graft versus host disease or Chron -disease. Little is known, however, about the interaction between BM-MSCs and macrophages (MP), therefore, in our work we aimed to clarify the functional consequences resulting from the relationship between these cell types, especially the changes resulting from possible alterations in the phagocytic activity and cytokine production. Since MSCs derived from the more easier accessible adipose tissue (AD-MSC) are also capable of exerting a highly similar immunomodulatory effect in the body as BM-MSCs, we aimed to investigate the similarities and/or differences between the effects of these two cell types on MPs as well. We used MSC cultures established from the bone marrow and adipose tissue of 10-12 weeks old mice. MPs were isolated from the peritoneal cavity of mice of the same age. We measured the intensity of yeast-or apoptotic cell (steroid-treated thymocyte) phagocytosis, and antigen-presentation capacity of MPs incubated in cultures with or without MSCs for 48 hours. The levels of TNF(an inflammatory cytokine), IL-10 (an anti-inflammatory cytokine) and PGE2 in the yeast-or apoptotic cell-containing culture supernates were determined. The same experiments were repeated using bacterial endotoxin-(LPS) or other TLR-ligand-(type 2 or 3) stimulated MPs. We found that both BM-and AD-MSCs were capable of enhancing the phagocytic and antigen-presentation activity of MPs, concurrently significantly altering the ratio of secreted cytokines in the culture supernates: while levels of TNF was not affected in general, elevated levels of IL-10 could be observed –without the need for direct cell-cell contact –, thus suggesting that MPs tend to show an anti-inflammatory (M2 or „alternative”) phenotype instead of a „classical” pro-inflammatory (M1) phenotype in the presence of MSCs. Polarization of MPs towards an M1 phenotype upon in vitro LPS activation was also hindered by the stromal cells. This effect was partially mitigated in the presence of indomethacin, a specific prostaglandin synthesis in hibitor, moreover, the concentration of PGE2 in the culture supernates increased more or less in parallel with IL-10 levels indicating that PGE2 can be an important mediator in the MSC-MP interaction. MSCs alter the ratio of T cells in favor of regulatory cells in a system where MPs are activating T cells with ovalbumin, in vitro. Our results therefore show that MSCs, regardless of their tissue of origin (bone marrow or adipose tissue), are capable of facilitating the polarization of MPs towards the „alternative” (M2) phenotype while inhibiting the development of the „classical” –or pro-inflammatory –(M1). This can play a pivotal role in the in vivo observed strong anti -inflammatory effect of MSCs.