A CpG dinukletidok eloszlásának és a CpG metiláció szerepének vizsgálata a sertés parvovirus genomjában

Abstract

A metiláció mind prokariótákban, mind eukariótákban megállapított jelenség. Magasabbrendű eukariotákban a CpG metiláció szerepet játszik a transzkripció szabályozásában, a kromoszóma stabilitásának megőrzésében, a patogének felismerésében, és a veleszületett immunrendszer aktiválódásában. A legtöbb eukariota genomban a CpG dinukleotidok száma azonban a várható érték alatt mozog. A kisméretű DNS vírusok esetében szintén megállapítást nyert a CpG dinukleotidok ritka előfordulása, amely valószínűleg evolúciós nyomásra alakult ki, a CpG-indukált immunválasz elkerülésére. A PPV Kresse törzsének genomjában a GC-tartalom 38,3 % (ez az arány az avirulens NADL-2 törzsnél 37,9 %), a CpG dinukleotidok valós/várt aránya 33,8. Az NADL-2 törzs a nem kódoló régiókban 60 CpG dinukleotidot, a fehérjéket kódoló szakaszon 40 CpG-t tartalmaz, utóbbiak eloszlása nem vélet lenszerű. Az első kódoló pozícióban (CGX) csak 3, a második kódoló pozícióban (XCG) 13, a harmadik kódoló pozícióban (XXC GXX) 24 CpG fordul elő. A metilációs állapot felderítése a biszulfitos kezelés után vált lehetővé. A módszer lényege, hogy a nem metilált citozinok a kezelés hatására uracillá alakulnak, ezáltal lehetőség adódik a metilált és a nem metilált helyek elkülönítésére, a kezelés előtti és utáni szekvencia- analízissel. A vírus virionba pakolódott formájának vizsgálatához a befertőzött sejtvonalak szövet i felülúszóját tisztítottuk, míg a replikaív forma vizsgálatához a fertőzött sejtekből vontuk ki a DNS-t. Eredményül azt kaptuk, hogy a permisszív PT-, és a szemipermisszív Cos7 sejtvonalakon szaporított vírus genomja nem, vagy csak kis mértékben metilált. A CpG-szám növeléséhez az NADL-2 törzs genomjában, két hasítóhely (3404. nukleotid, NCoI hasítóhely; és 4024. nukleotid, SacI hasítóhely) közötti szakaszt módosítottunk anélkül, hogy a kapszid fehérjét kódoló gén szekvenciája megváltozna. A permisszív PT sejtekbe történő transzfekció után immunfluoreszcenciával vizsgáltuk a vírusok fertőzőképességét. A mutáns vírusok és az NADL-2 törzs in vitro fertőzőképessége között nem mutatkozott számottevő különbség.

DNA methylation is observed both in eukaryote and prokaryote organisms. In higher eukaryote organisms the methylation plays an important role in the regulation of transcription factors, preservation of chromosome stability, detection of pathogens and activation of innate immunity. In most of the small DNA viruses the CpG dinucleotides are underrepresented, just like in the eukaryotic genomes. It is probably the result of an evolutionary pressure to avoid CpG-mediated immune responses. The GC content of Kresse strain is 38,3 % (of the NADL-2 strain is 37,9 %), the observed/expected CpG ratio is 33,8. The non coding regions of NADL-2 contain 60 CpGs and the protein coding regions have 40 CpGs, the distribution of CpG dinucleotides in the coding sequences is not random. In the first coding position (CGX) 3, in the second coding position (XCG) 13 and in the third position 24 CpGs can be found so it shows an ascending tendency. To explore the methylation status of PPV genome we applied bisulphite sequencing. This method converts cytosine residues to uracil, but leaves 5-methylcytosine residues unaffected, thus it makes it possible to distinguish the methylated sites from the unmethylated ones using sequence analysis. To determine the methylation status of different genomic forms the packaged negative strand was isolated from culture supernatants while the positive strand (characteristic to the replicative genome) was extracted from infected cells. The PPV genome was found to be hypomethylated in every form regardless that the virus was originated from the permissive PT or the semipermissive Cos7 cell lines. To increase the CpG content in the genome of NADL-2 strain we modified the part of the genome between the restriction sites of NcoI (3404.) and SacI (4024.) without changing the VP2 protein coding sequence. Infective clones of the mutant viruses were transfected and the rescued viruses were tittered on permissive PT cells by indirect immunofluorescence assay. There was no significant difference in the infectivity of the mutant and the wild type virus indicating that the extra CpG sites have no remarkable biological effects either on viral production or viral growth in vitro.